单核细胞增生性李斯特菌简称单增李斯特菌,是一种常见的食源性致病菌,具有污染范围广、环境耐受性强、致死率高等特点。人们摄食被单增李斯特菌污染的食物后,可引起脑膜炎、败血症、脓肿及孕妇流产等一系列疾病。近年来,世界各国多次爆发单增李斯特菌的感染事件,造成了巨大的财产损失和人员伤亡,引起人们的高度重视。因此,建立食品中单增李斯特菌快速、准确、可靠的检测方法具有十分重要的意义。传统的单增李斯特菌分离鉴定方法具有费时耗力等缺点,不能满足快速检测的需要,而免疫学方法与分子生物学方法以其检测时间短、准确率高等优点被广泛应用到致病菌快速检测领域,并取得了良好的效果。本研究将免疫磁珠与双重PCR联用建立了单增李斯特菌的快速检测的方法。此外,本研究还制备了单增李斯特菌膜蛋白p60对应的单链抗体。主要研究结果如下:(1)PCR扩增单增李斯特菌iap基因,将其插入pET-28a(+)质粒中,转化E.coli BL21(DE3)成功构建p60蛋白表达菌株,经IPTG诱导表达获得单增李斯特菌p60蛋白,并经镍柱纯化后获得纯化的p60蛋白。(2)以p60蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔,四次免疫后收集血清,经Protein G纯化柱纯化后获得p60蛋白多克隆抗体,效价可达1:12500以上。交叉反应实验表明,该抗体可识别李斯特菌属的菌株,而对其它菌属的细菌无交叉反应。用碳二亚胺法将p60多克隆抗体与羧基修饰的磁珠偶联制备李斯特菌的免疫磁珠。菌体捕获实验优化结果表明,免疫磁珠用量为20μL,孵育时间为30min时,对单增李斯特菌捕获率最高。(3)使用李斯特菌属特异性引物和单增李斯特菌特异性引物,以免疫磁珠捕获的菌体为模板建立免疫磁珠与双重PCR联用的单增李斯特菌检测方法。在最优化条件下,该方法对纯培养的单增李斯特菌灵敏度可达10~6CFU/mL。以1CFU/g的单增李斯特菌量对猪肉样品进行人工染菌后,增菌8h即可利用此方法成功检测到单增李斯特菌。(4)以p60蛋白为免疫原免疫BALB/C小鼠,并构建了库容为1.4×10~7的噬菌体展示单链抗体文库,经过三轮淘选和单克隆筛选,获得了能够特异性识别单增李斯特菌的噬菌体单链抗体P2。经单链抗体表达载体的构建、原核表达与纯化,制备了单增李斯特菌单链抗体P2。利用P2建立的ELISA对纯培养的单增李斯特菌的灵敏度可达10~6CFU/mL。