论文部分内容阅读
糖尿病是当前最严重的慢性流行性疾病之一,其并发症是危害人类健康的首要原因。近年来,多项研究表明Ⅱ型糖尿病与各种形式的慢性肝病之间互相关联和影响,并形成复杂的恶性循环关系。其中肝源性糖尿病是一种典型的Ⅱ型糖尿病与多种肝脏类疾病并发的复杂病症,而胰岛素抵抗是其病理学的主要发病原因。胰岛素抵抗的特点是肝脏、肌肉和脂肪细胞对血液胰岛素水平不敏感,阻碍了组织细胞对葡萄糖的摄取和代谢利用,进一步导致高血胰岛素、高血糖等症状。然而针对胰岛素抵抗的药物治疗通常会受到空间性以及时效性的制约,并且这些药物也不能直接应用于肝脏疾病的治疗。简而言之,常规用于胰岛素抵抗的药物疗法,通常难以兼顾糖尿病与肝脏疾病并发的复杂情况,并且现有关于糖尿病发病前期的诊疗方案,治疗效果均非常有限,因此我们迫切需要解决此类问题的新思路和新方法。当前利用合成生物学方法,针对特异性临床指标设计合成的基因电路感受器,如胆汁酸感受器、尿酸感受器、脂肪酸感受器等,并以此来定制化的细胞,已经可以有效地应对高胆汁酸、高尿酸、高血脂等病症,并有效改善疾病模型动物体的病理状态。随着合成生物学研究中基因电路的不断综合化、多元化,以定制细胞为核心理念的细胞疗法,已经在各种复杂疾病的诊断和治疗应用研究中展开。本论文中我们利用合成生物学方法设计并合成的智能化自我识别病理指标和回馈应答的基因环路,用于实现糖尿病与多种疾病并发的协同治疗。以“人工可控定制细胞用于糖尿病诊疗的研究”为中心,分别以“设计合成齐墩果酸（OA）调控基因环路定制细胞用于肝源性糖尿病治疗”和“设计合成智能化胰岛素传感器定制细胞用于胰岛素抵抗治疗”两个方向开展糖尿病治疗的应用研究。1.设计合成齐墩果酸（OA）调控基因环路定制细胞用于肝源性糖尿病治疗。第一,我们分析基因环路设计构建的必要条件:（1）植物界广泛分布的齐墩果酸（OA）具有保肝效应和抗炎、抗氧化、抗癌等众多潜在的药理学活性,是我国批准并用于临床的非处方类保肝药物;（2）GPBAR1可以被各种两亲性代谢物（包括胆汁酸）激活,并行驶cAMP依赖的信号途径;（3）OA可作为强的GPBAR1激动剂。通过整合以上条件,构建完成包括感受器（GPBAR1）、处理器（TetR-hCREB1）和效应器(PhCMVmin*-Reporter)三个部分,并由OA和Dox共同调控的转基因表达开关装置。第二,定性测试该基因开关装置的“ON”和“OFF”工作特性,调试并优化其工作效率,在HEK293细胞中对比非诱导组,OA诱导可达30倍以上的激活,同时Dox可以达到关闭99%转基因表达的效果。经过检测证明该装置在体外和体内均表现出良好的转基因表达动力学特征。第三,研究OA调控的治疗基因环路定制细胞在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病兼并肝脏疾病的小鼠模型中可调控性分泌胰岛素、胰高血糖素样肽（GLP-1）等功能分子,监测短长期血糖控制效果和肝脏修复等多种指标的检测。其中GLP-1的表达量可以持续15天处于150 pM的高水平状态,胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）降低50%;同时肝功能相关的AST,ALT均有50%以上的调低,表明我们设计优化的基因环路,经OA诱导可以精准调控shGLP-1的表达,使得肝源性糖尿病模型小鼠的多种代谢异常症状同时得到有效的改善。2.设计合成智能化胰岛素传感器定制细胞用于胰岛素抵抗治疗。首先,我们根据查找相关信息,包括:（1）胰岛素与胰岛素受体的结合可引发胰岛素受体的中多个酪氨酸残基的自磷酸化,导致其下游细胞信号丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路活化;（2）MAPK进一步磷酸化激活重组转录因子TetR-ELK1;（3）活化的TetR-ELK1与PhCMV*-1结合时就能驱动功能基因表达。其次,整合以上信息我们设计并组装完成包括:胰岛素受体、TetR-ELK1与PhCMV*-1等3组模块的胰岛素传感器。从多方面证明设计的智能化胰岛素传感器工作原理后,我们对其工作效率进行调试优化,并证明了其在体外和体内均具有优良的转基因表达动力学特征。第三,我们通过在极度匮乏胰岛素的模型小鼠体内,注射不同剂量胰岛素,来模拟血液中胰岛素水平变化,其中可以灵敏检测胰岛素浓度在1 ng/mL的低水平胰岛素抵抗症状。并证明了我们设计的胰岛素传感器可以根据胰岛素剂量,且依赖性产生的脂联素蛋白（Fc-adiponectin）。最后,在ob/ob和DIO疾病模型动物体内进行中长期治疗应用研究,实验结果显示我们设计的胰岛素传感器定制细胞,可以自动识别体内高血胰岛素指标,并触发脂联素的剂量依赖性表达,增加肝脏、脂肪组织对胰岛素的敏感性,逆转胰岛素抵抗综合征。其中胰岛素抵抗均达到50%以上的下调治疗效果。证实了我们的治疗方法可以极大地改善疾病模型的高血胰岛素以及胰岛素抵抗综合征的症状。综合本论文中我们所研究的主要内容:第一,利用天然绿色小分子激发输入因子,结合其自身药理学优势,设计、合成的基因表达调控线路,可以实现协同治疗和药物的精准控制。针对肝源性糖尿病治疗,设计了齐墩果酸调控基因环路的“二合一”协同治疗方案,即通过合成生物学方法将齐墩果酸的药理学活性和胰高血糖素样肽的改善胰岛素抵抗功能完美地集合起来。第二,设计、合成的胰岛素传感器定制细胞可以用于检测、诊断胰岛素抵抗这一糖尿病早期症状,并进行及时纠正、治疗,避免发展成后期的糖尿病。针对胰岛素抵抗综合征中以高血胰岛素为靶标,设计的可自识别智能调控的胰岛素传感器,能实现更为精准的胰岛素抵抗检测,为糖尿病早期的准确诊断和有效治疗提供理论依据。我们提出的小分子开关系统进一步扩充了哺乳动物合成生物学工具盒,为将来设计、合成更复杂、更高层次的基因网络奠定了坚实基础。同时我们提出的自给自足式的基因线路设计在监测某种代谢疾病标记物时能同时协调表达治疗药物,这样的治疗设计理念将有望引领未来个性化精准医疗新时代。