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谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)是一种具有解毒功能的酶,对各种有害的外源性化合物(如致癌物质和诱变剂)与细胞内源性化合物(如脂质过氧化合物)均有分解功能。GST在寄生虫的抗氧化系统中发挥着重要的作用,它可以除去大部分的外源性和内源性的亲电子化合物,有助于寄生虫在宿主内的生存。GST蛋白酶在一些寄生虫中已被鉴定并有所研究,如犬恶丝虫、马来丝虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝片吸虫及猪带绦虫等,但关于旋毛虫GST的研究目前尚未见报道。本研究利用生物信息学分析了Ts GST与其它寄生虫及模式生物GST的进化关系,应用分子克隆基因技术表达并纯化了一种旋毛虫谷胱甘肽转移酶Ts GST,获得r Ts GST蛋白及其免疫血清。通过SDS-PAGE和Western blot分析了该重组蛋白的抗原性及免疫原性,RT-PCR、Western blot及免疫荧光试验(IFA)鉴定了Ts GST基因在旋毛虫不同发育虫期的转录、表达及其在虫体的定位;观察了r Ts GST免疫小鼠后的抗体应答类型及对宿主的免疫保护作用、免疫血清对旋毛虫侵入肠上皮细胞(IEC)的影响及免疫血清介导的巨噬细胞对旋毛虫的杀伤作用(ADCC)。运用生物化学方法分析了r Ts GST的酶活性及其最佳反应条件。本研究鉴定了r Ts GST的性质及其功能,为阐明旋毛虫的侵入、生存及其与宿主小肠上皮细胞的相互作用和致病机制奠定基础。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞系旋毛虫(Trichinella spiralis)由郑州大学基础医学院寄生虫教研室昆明小鼠传代保种。BALB/c小鼠、4-6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为小鼠肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),是由本教研室分离培养。2.r Ts GST的免疫学分析将r Ts GST免疫BALB/c小鼠,获得r Ts GST免疫血清,应用旋毛虫感染小鼠血清及r Ts GST通过ELISA及Western blot鉴定r Ts GST的抗原性。3.Ts GST基因的转录、表达及定位收集旋毛虫的感染性幼虫、成虫、新生幼虫及肌幼虫,提取总RNA进行RT-PCR,扩增Ts GST基因及内参基因GAPDH,检测Ts GST基因的表达时相。收集小鼠感染旋毛虫后3d与7d的成虫,新生幼虫及肌幼虫,制备可溶性抗原进行Western blot,用r Ts GST免疫血清对不同虫期的可溶性抗原进行识别,检测Ts GST蛋白在不同虫期是否有表达。收集旋毛虫感染性幼虫、3d与7d成虫、新生幼虫及肌幼虫,IFA检测r Ts GST免疫血清与旋毛虫不同发育时期虫体的反应性,观察Ts GST蛋白在虫体的定位。将收集的不同期虫体进行石蜡包埋组织切片,通过IFA观察Ts GST蛋白在不同时期虫体的具体定位。4.r Ts GST蛋白的免疫保护性分析将60只BALB/c小鼠随机分为3组(每组20只):分别为r Ts GST蛋白免疫组、佐剂及PBS对照组。按20μg蛋白/只小鼠的剂量进行皮下多点注射,每隔10 d免疫1次,共3次,末次免疫后10 d,每只小鼠经口攻击感染300条旋毛虫肌幼虫。攻击感染后7d每组各剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫并计算成虫减虫率,剩余小鼠感染后42 d剖杀,收集肌幼虫并计算肌幼虫减虫率。同时收集小鼠免疫后不同时间血清,利用ELISA分析r Ts GST蛋白免疫小鼠所引起的免疫反应类型。5.r Ts GST免疫血清对旋毛虫侵入IEC的影响及ADCC作用为了观察r Ts GST免疫血清体外对旋毛虫侵入IEC的影响,将r Ts GST免疫血清、感染后42 d小鼠血清及正常小鼠血清分别与半固体培养基按1:10混合,加入感染性幼虫,覆盖到IEC细胞表面,37℃、5%CO2条件下培养2 h,观察幼虫侵入IEC细胞的情况,计算侵入率。将旋毛虫肌幼虫与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养,并加入不同浓度的重组蛋白免疫血清(1:5、1:50、1:100、1:200及1:500),37℃、5%CO2条件下培养至30h,观察肌幼虫存活的情况,计算死亡率,观察r Ts GST免疫血清介导的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。6.Ts GST与寄生虫及模式生物GST的进化关系分析在Gen Bank搜索并保存其它生物GST的氨基酸序列,利用MEGA6.0软件构建进化树,构建进化树遵从最佳简约原则,根据进化树分析Ts GST与其他物种的进化关系。选取旋毛虫属中的本土旋毛虫(T.nativa)和伪旋毛虫(T.pseudospiralis)以及血吸虫属中的曼氏血吸虫和日本血吸虫的GST氨基酸序列,利用Clustal W软件对氨基酸序列进行氨基酸序列的相似性分析。7.r Ts GST的酶活性及其性质分析GST具有催化还原性谷胱甘肽GSH与2,4二硝基苯CDNB结合的能力,其结合产物的光吸收峰值波长为340nm,通过测定340nm处吸光度上升速率,计算出GST的酶活力。r Ts GST酶在不同温度和不同p H值的反应条件下,观察该酶反应的最佳温度和p H值,以及金属离子与其他试剂对酶活性的影响。结果1.ELISA结果显示,r Ts GST免疫血清与旋毛虫可溶抗原产生阳性反应;Western blot发现,抗r Ts GST血清可识别旋毛虫可溶性抗原及纯化的r Ts GST,均在24 k Da处显示明显条带,表明r Ts GST具有较强的抗原性,且Ts GST是旋毛虫可溶性抗原的组分。2.RT-PCR分析结果表明,Ts GST基因在旋毛虫感染性幼虫、成虫、新生幼虫和肌幼虫4个时期均有表达;Western blot显示Ts GST蛋白在旋毛虫各个虫期都有表达。IFA结果显示,r Ts GST免疫血清能够与旋毛虫不同发育时期的虫体发生阳性反应(显现黄绿色荧光);虫体组织切片IFA结果显示Ts GST主要位于虫体的皮层、杆状体和生殖原基部位。3.r Ts GST蛋白免疫小鼠后可以产生抗Ts GST的高滴度抗体,诱导产生了以Th2免疫反应为主的免疫反应(表现为高水平的Ig G1)。旋毛虫攻击感染后,r Ts GST免疫小鼠的成虫和肌幼虫减虫率分别为35.71%和38.55%。4.r Ts GST免疫血清体外对旋毛虫侵入IEC具有明显的抑制作用,r Ts GST免疫血清、感染血清及正常血清3组的幼虫侵入率分别31.0%,11.36%及78.96%(χ2=46.4,P<0.05)。ADCC实验结果显示,免疫血清组的虫体死亡率70%,明显高于正常血清组的12%(χ2=69.048,P<0.001),虫体死亡率具有抗体剂量依赖性(χ2=173.332,P<0.001)。5.进化树分析发现,Ts GST与旋毛虫属中的本土旋毛虫和伪旋毛虫GST的进化最近,与人类GST的进化关系最远。氨基酸序列相似性比对结果显示,Ts GST氨基酸序列与本土旋毛虫、伪旋毛虫、曼氏血吸虫及日本血吸虫的GST氨基酸序列的相似度分别为60%、65%、31%、30%。6.r Ts GST生化性质分析结果显示,纯化后的r Ts GST蛋白具有GST酶活性,最适反应条件是温度为40℃,p H 6.3–7.2。H2O2可完全抑制酶的活性,Mn2+和Na+离子可部分抑制酶的活性,Ca2+、Mg2+和K+离子对GST酶活性无明显影响,但Ni2+离子可将酶活性增加54.7%。结论1.重组的Ts GST蛋白具有良好的抗原性及GST的酶活性;2.Ts GST在旋毛虫不同发育期均有转录与表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和生殖原基;3.r Ts GST免疫血清在体外对旋毛虫侵入IEC具有明显的抑制作用,通过ADCC作用对肌幼虫具有明显的杀伤作用,表明GST是旋毛虫幼虫的侵入相关蛋白。