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目的:观察Neuritin过表达对Neuralized和Neuralized介导的Notch信号通路的影响,明确Neuritin与Neuralized介导的Notch信号通路的关系,探讨Neuritin在调控细胞命运,调节细胞迁移,分化和增殖中的作用机制。
方法:
(1)运刚免疫共沉淀技术(immunoprecipitation,IP)验证Neuritin与Neuralized之间的相互作用
①构建pcDNA3.1-his/myc-neuritin质粒pcDNA3.1-flag-neuralized质粒;
②利用脂质体介导法将上述真核表达载体共转染至HEK293细胞;
③采用免疫共沉淀技术(正向和反向)检测上述转染细胞中Neuritin和Neuralized的相互作用。
(2)利用真核表达技术,观察Neuritin过表达对Neuralized介导的Notch信号通路的影响
①构建pEGFP-C1-JAG1-TB荧光表达载体;
②利用脂质体介导法将pIRES-HA-Jag1或pEGFP-C1-JAG1-TB质粒,bpcDNA3.1-flag-neuralized质粒,pcDNA3.1-his-neuritin质粒,分组转染至HEK293细胞;
③用western-blot技术检测三组细胞中Neuritin,Neuralized和JAG1的表达情况;
④利用细胞内定位技术观察三组细胞中Neuritin蛋白对JAG1-TB蛋白内吞的影响。
结果:
(1)Neurtitin蛋白和Neuralized蛋白免疫共沉淀检测结果显示:细胞内Neuritin蛋白可Neuralized蛋白发生相互作用;
(2)利用western-blot技术检测Neuritin蛋白对Neuralized介导的Notch配体蛋白JAG1表达水平的影响结果显示:Neuritin蛋白能够抑制Neuralized蛋白介导的JAG1蛋白表达下调;
(3)利用细胞内定位技术观察三组细胞中Neuritin对Neuralized介导的JAG1内吞的影响的实验结果显示:Neuritin蛋白可以部分的抑制JAG1蛋白的内吞。
结论:
(1)Neuritin蛋白能够与Neuralized蛋白相互作用;
(2)Neuritin蛋白能够抑制Neuralized蛋白介导的JAG1蛋白表达下调;
(3)Neuritin蛋白能够部分抑制Neuralized蛋白介导的JAG1-TB蛋白内吞,进而影响Notch信号通路。