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研究背景和研究目的长非编码RNA(IncRNA)是一类长度超过200nt,无编码能力的转录产物。IncRNA可以在表观遗传修饰水平、转录水平和转录后水平等多个层次调控基因表达,从而在分化、增殖、凋亡、迁移和多能干细胞再生等多个生理过程中起到重要作用。血管内皮细胞(VECs)位于血管的最内层,其凋亡与动脉粥样硬化、血栓形成和斑块损伤等众多心血管疾病相关。目前血管内皮细胞凋亡相关研究主要集中在蛋白水平上,并没有直接与血管内皮细胞凋亡相关的IncRNA的报道。血清和生长因子饥饿处理人脐带静脉内皮细胞是一个很好的诱导血管内皮细胞凋亡的模型。在之前的研究中,我们发现苯并噁嗪衍生物ABO可以提高血清和生长因子饥饿下的HUVECs存活率;在ApoE-/-小鼠中,ABO可以抑制oxLDL诱导的VECs凋亡;但目前ABO抑制凋亡的机制尚不清楚。因此,我们将ABO作为一个VECs凋亡抑制剂,用以寻找新的VECs抑制凋亡因子。综上所述,本论文利用ABO寻找和研究控制血管内皮细胞凋亡的新因子和信号通路对控制血管稳态和重构具有重要意义,同时也为防治血管疾病的新药物研发奠定基础。研究内容1.利用小分子化合物ABO寻找控制血管内皮细胞凋亡的新因子。2.研究长非编码RNACERNA1调控血管内皮细胞凋亡的分子机制。3.研究CERNA1在病理条件下—动脉粥样硬化中的作用(ApoE-/-小鼠)。4.研究CERNA1在血管内皮细胞中的表达调控机制。研究方法1.本论文以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为细胞模型,以ApoE-/-小鼠为动物模型,以小分子化合物ABO为血管内皮细胞凋亡抑制剂进行相关研究。2.本论文以血清和生长因子饥饿处理HUVECs模拟体内局部缺血对血管内皮细胞的影响;以氧化性低密度脂蛋白处理HUVECs模拟体内动脉粥样硬化对血管内皮细胞的影响;以高脂喂养ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化的动物模型。3.过表达和敲低基因表达的体系:(1)在细胞中过表达基因,构建过表达质粒或合成miRNA的mimics,再利用脂质体转染细胞;(2)在细胞中敲低基因表达,设计、合成、筛选有效率的小干扰RNA或miRNA的inhibitor,再利用脂质体转染细胞;(3)在ApoE-/-小鼠中过表达CERNA1,构建过表达质粒,慢病毒包装,尾静脉注射小鼠,注射两周后检测效果。4.基因表达检测体系:IncRNA和mRNA水平检测利用荧光定量PCR技术;miRNA水平检测利用特异性miRNA荧光定量PCR技术;蛋白及磷酸化水平利用Western Blot和相应抗体,其中TIA-1的磷酸化,利用TIA-1抗体免疫沉淀后用丝氨酸磷酸化抗体进行检测。5.miRNA相关靶点预测及验证:(1)lncRNA上miRNA结合位点预测:microinspector 数据库;(2)miRNA 靶基因预测:miRDB,Targetscan 和 DIANA LAB数据库;(3)miRNA靶点验证:将含有靶点的序列作为3’UTR连入LUCI质粒内,与miRNA mimic共同转染细胞,检测LUCI酶活的变化。6.CERNA1核质分布的检测:RNA-FISH和RNA的核质分离提取。7.表观遗传修饰检测体系:(1)DNA甲基化分析:亚硫酸氢钠处理后测序(BSP);(2)组蛋白修饰分析:利用H3K4me3和H3K9ac特异的抗体进行染色质免疫沉淀(ChIP),随后PCR检测相应DNA片段富集水平。8.动脉粥样硬化分析指标:(1)脂质积累:油红O染色分析斑块的数量和大小以及ELISA检测血浆中的脂质;(2)免疫反应:ELISA检测血浆中的炎性因子;(3)斑块稳定性:平滑肌数量、基质金属蛋白酶活性和坏死核心。研究结果1.利用小分子化合物ABO发现调控血管内皮细胞凋亡的新因子—CERNA1(1)ABO显著抑制血清和生长因子饥饿引起的血管内皮细胞凋亡。(2)ABO显著上调血管内皮细胞中长非编码RNACERNA1的表达。(3)过表达CERNA1抑制饥饿诱导的血管内皮细胞凋亡。(4)CERNA1在细胞质和细胞核中均有分布。2.CERNA1通过靶向miR-4707-5p和miR-4767进而抑制饥饿诱导的血管内皮细胞的凋亡(1)CERNA1可以作为竞争性内源RNA—结合miRNA-4707-5p和miRNA-4767。(2)miRNA-4707-5p和miRNA-4767分别通过靶向两个凋亡抑制因子—API5和BCL2L12进而促进细胞凋亡。(3)CERNA1 与 API5 和 BCL2L12 分别竞争结合 miRNA-4707-5p 和miRNA-4767,从而促进这两个凋亡抑制因子的表达。3.CERNA1在血管内皮细胞中通过表观遗传正调控凋亡促进因子BCL2L10的表达(1)CERNA1正调控基因组邻近基因BCL2L10的RNA水平。(2)CERNA1通过改变基因组上邻近基因BCL2L10启动子区的表观遗传修饰(降低DNA甲基化,提高H3K4me3和H3K9ac的修饰水平)进而促进其表达。(3)BCL2L10在血管内皮细胞中是一个凋亡促进因子。(4)小分子化合物ABO可通过调节CERNA1的核质分布进而改变细胞命运。4.CERNA1在动脉粥样硬化中的作用(1)过表达CERNA1抑制oxLDL引起的血管内皮细胞凋亡。(2)构建过表达CERNA1的ApoE-/-小鼠。(3)过表达CERNA1能够稳定动脉粥样硬化斑块。(4)过表达CERNA1通过提高平滑肌及巨噬细胞中的API5的表达进而抑制凋亡从而稳定斑块。5.小分子化合物ABO以TIA-1依赖的方式上调CERNA1的表达(1)在VECs中敲低TIA-1下调CERNA1的表达。(2)ABO通过提高TIA-1蛋白水平和抑制其磷酸化来促进CERNA1的表达。结论1.CERNA1通过竞争性内源RNA途径抑制血管细胞凋亡:CERNA1靶向两个miRNA(miRNA-4707-5p和miRNA-4767),进而上调两个凋亡抑制因子API5和BCL2L12的表达,从而抑制细胞凋亡。2.CERNA1通过表观遗传修饰调控途径促进血管内皮细胞凋亡:CERNA1可以对邻近基因BCL2L10的启动子区进行表观遗传修饰(降低DNA甲基化水平,提高H3K4me3和H3K9ac的组蛋白修饰水平),进而增加凋亡促进因子BCL2L10的表达,从而促进细胞凋亡。3.ABO不仅上调CERNA1的表达,还可以改变CERNA1在核质中的分布比例:提高CERNA1在细胞质中的比例,两个方面共同作用进而抑制细胞凋亡。4.在ApoE-/-小鼠中过表达CERNA1可以通过提高斑块内平滑肌细胞和巨噬细胞的API5蛋白水平进而减少斑块内的细胞凋亡,从而提高动脉粥样硬化斑块的稳定性。5.小分子化合物ABO以TIA-1依赖的方式促进CERNA1的表达。