蛋鸡的产蛋性能是最主要的经济性能,鸡蛋中大部分沉积的蛋白和脂类物质并非由卵巢直接合成,而是由肝脏合成并转运沉积至蛋黄中,肝脏是鸡十分重要的脂类代谢器官。家禽卵泡的发育强烈依赖雌激素的诱导,肝脏同样是雌激素重要的靶器官。雌激素作为重要的固醇类激素,发挥着多种生理功能,研究雌激素的靶基因和调控网络成为研究的热点。本研究利用新一代高通量技术,对雌激素处理的鸡肝脏进行转录组测序,获得了大量雌激素的靶基因,构建了鸡肝脏中雌激素调控网络。进一步通过个体和细胞实验对重要的候选基因甲状腺激素快速反应蛋白基因(THRSP)和研究较少的黑皮质素受体辅助蛋白基因(MRAP)进行了验证,并通过ChIP-qPCR技术研究了雌激素对THRSP的调控分子机制。研究一:雌激素处理鸡肝脏转录组研究本研究以河南地方鸡卢氏绿壳蛋鸡为实验材料,选取6只体重相近的10周龄卢氏鸡随机分为两组,每组三只,实验组胸肌注射2 mg/kg体重的17β-雌二醇,对照组注射雌二醇溶剂。处理12小时后收集肝脏,提取RNA,构建转录组文库,运用Illumina HiSeq 2500测序平台进行双端测序;经过过滤原始测序数据、质量评估与基因组比对后,统计分析Reads获得基因表达定量结果,筛选差异表达基因,获得大量雌激素靶基因,并对差异基因进行GO、KEGG富集分析,构建雌激素调控网络。主要实验结果如下:1、与对照组相比,雌激素处理组鸡血清中TG含量显著升高;通过油红O染色发现肝脏中脂肪滴增多;肝脏中极低密度脂蛋白基因(apoVLDL-II)和载脂蛋白B(APOB)表达量显著升高。2、成功构建了6个鸡肝脏cDNA文库,通过上机测序共获得883427404条Reads,总数据量达到78.64Gb。对数据进行预处理,与基因组比对,样品间相关性分析的结果均表明RNA-Seq整体质量较好、准确度较高,满足进一步分析的要求。3、转录组数据共获得15556个基因的表达定量结果;通过生物信息学分析预测,挖掘了11964个潜在的新基因。4、通过组间差异分析,共筛选得到了962个差异基因,与对照组相比545个上调,417个下调。新基因中筛选得到869个差异基因,其中382个上调,486个下调。5、通过对差异基因进行GO,KEGG富集分析,共富集到59个显著的GO条目和14个显著的KEGG通路。显著富集的GO和KEGG与脂肪代谢相关,这其中与脂肪相关的GO多达17条,与脂肪相关的KEGG通路更是多达7条。6、通过荧光定量验证了随机挑选的10个基因,基因差异性结果与转录组数据基本一致,表明转录组数据可靠。研究二:THRSP受雌激素调控的分子机制的研究THRSP为实验一筛选得到的重要的与脂质合成相关的候选基因,为了研究THRSP的调控机制,实验以卢氏绿壳蛋鸡为材料,为了构建THRSP的时空表达谱,分别采取了10、15、20、30、35周龄的鸡肝脏组织和10、30周龄鸡的11种不同组织,提取RNA进行qPCR。为了研究雌激素对THRSP表达的影响,选取了48只鸡分为8组,每组6只,其中四组分别注射0,0.5,1,2mg/kg体重的17β-雌二醇,处理12小时后收集肝脏和腹脂组织,提取RNA进行qPCR。另外四组同样处理,注射24小时后收集肝脏和腹脂组织,提取RNA进行qPCR。为了在细胞水平进一步验证,使用18胚龄鸡胚分离培养鸡肝脏原代细胞,在培养基中分别添加0,1,50,100 nM 17β-雌二醇,12小时后收集细胞,提取RNA进行qPCR。为了验证雌激素受体与THRSP启动子是否结合,采用雌激素受体抗体,使用雌激素处理过的肝脏组织进行ChIP-qPCR进行验证。主要实验结果如下:1、时空表达谱结果显示THRSP主要在鸡的肝脏和腹脂中高丰度表达,在其它组织中表达量很低或不表达。且肝脏THRSP随着鸡性成熟而表达量逐渐增加,在产蛋高峰时表达量最高。2、在个体水平和细胞水平上,雌激素处理能显著提高肝脏和腹脂组织中THRSP的转录表达。3、在细胞水平上,雌激素拮抗剂ICI能够有效抑制雌激素对THRSP的诱导作用。4、通过对THRSP启动子区域进行分析,发现了一个典型的雌激素受体结合元件ERE,通过ChIP-qPCR技术,结果表明雌激素受体ERα能够有效结合在该ERE位点。研究三:雌激素对黑皮质素受体辅助蛋白基因调控机制研究黑皮质素受体辅助蛋白(MRAP和MRAP2)是小的单向跨膜蛋白,它能够调节黑皮质素受体(MCR)家族的生物学功能。MCRs包含五种受体(MC1R-MC5R),在哺乳动物中具有不同的生理作用。鸡基因组也预测出五种MCR和两种MRAPs,人们对它们的表达、调控和生物学功能知之甚少。转录组数据中发现肝脏中仅有MC5R和MRAP的表达,未见其他基因的表达,与已有哺乳动物上研究结果差异较大,因此对该7个基因进行了系统的研究。实验材料同实验二,主要研究结果如下:1、对MRAP和MRAP2编码区序列进行了扩增测序,结果显示核苷酸序列和基因组参考序列一致。序列分析表明MRAP基因编码120个氨基酸的蛋白,MRAP2编码206个氨基酸的蛋白。2、对MRAP和MRAP2氨基酸序列分析,结果表明两个蛋白均含有一个跨膜域,没有信号肽;不同物种间MRAP氨基酸序列同源性较低(<50%),但N端和跨膜域序列相对较为保守;MRAP和MRAP2的氨基酸序列相比对,同源性较低(37%)。3、构建了MRAP和MRAP2的系统进化树,结果表明,MRAP和MRAP2分为两个大的分支。鸟类MRAP与哺乳动物和爬行动物MRAP归到平行的两个分支中,MRAP2与MRAP结果类似。4、组织表达谱结果显示MRAP在肾上腺、肝脏、脾脏、腺胃、下丘脑和肺中表达,而MRAP2主要在肾上腺和下丘脑中表达。所有MCRs基因均在肾上腺表达,在其他组织中分布则各不相同,在肝脏中只检测到MC5R的表达。5、15-35周龄鸡肝脏中MRAP的mRNA和蛋白水平随着鸡的性成熟而增加,MC5R的mRNA水平没有显著变化,PPARγ的mRNA水平逐渐下降。6、在个体水平上,雌激素处理能显著增加肝脏中MRAP的mRNA和蛋白水平,减少PPARγ的mRNA水平,对MC5R的表达没有影响。7、在细胞水平上,雌激素处理能显著增加MRAP的mRNA水平,减少PPARγ的mRNA水平,对MC5R的表达没有影响。