流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae,Hi）是一种常见的革兰阴性小杆菌,通常定植在人鼻咽部,可引起上呼吸道感染、儿童脑膜炎、肺炎、中耳炎和成人慢性阻塞性肺疾病急性加重等多种疾病。其中,不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi）和b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）是临床流感嗜血杆菌感染中分离出的主要亚型。随着Hib疫苗的广泛应用,Hib所致感染的发病率显著下降,而NTHi相关疾病的发病率相对上升。且近年来,NTHi对多种抗生素的耐药性正逐渐增强,给临床诊断和治疗带来了新的挑战,但目前为止仍没有预防NTHi感染的有效手段。因此,探究NTHi的致病机制,对于寻找预防和治疗NTHi感染更有效的方法显得至关重要。研究发现,NTHi外膜蛋白P6在菌株间高度保守,且在免疫保护反应中发挥着重要作用,成为目前国内外学者研究的焦点之一。但目前关于P6蛋白与宿主间的相互作用及其生物学功能研究较少,对其在NTHi致病过程中所发挥的作用研究并不深入。本研究通过构建人鼻咽上皮细胞NP69的酵母GAL4 AD融合c DNA文库,应用酵母双杂交技术寻找宿主中与外膜蛋白P6相互作用的配体蛋白,探究P6蛋白的特性及生物学功能,为深入研究P6蛋白在NTHi感染宿主过程中的作用提供理论依据,从新的角度诠释NTHi的致病机制,为不可分型流感嗜血杆菌的防治提供新的思路。首先,用Trizol试剂从人鼻咽上皮细胞NP69中提取细胞总RNA,应用Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript（SMART）技术合成c DNA第一链,再利用LD-PCR合成高质量的全长c DNA双链,经CHROMA SPIN-400纯化柱去除双链c DNA中200bp以下的小片段;再将纯化后的双链c DNA、p GADT7-Rec及denatured Yeastmarker TMCarrier DNA共转化酵母Y187感受态细胞,构建以p GADT7-Rec为载体的NP69细胞酵母GAL4 AD融合c DNA文库。经计算文库滴度为1.67×1010CFU/ml。通过PCR检测文库多态性,1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物大小在0.3～2kb之间,表明所构建文库具有良好的多态性。然后,以NTHi ATCC 49247菌株基因组为模板,通过PCR扩增特异性P6基因片段,使用Eco R I和Bam H I双酶切后,将其克隆于诱饵载体p GBKT7中;经菌落PCR及双酶切鉴定后,再通过p GBKT7载体上的T7通用引物对插入片段进行测序,测序结果经BLAST比对与P6基因序列一致;将构建好的诱饵质粒p GBKT7-P6转化酵母AH109和Y187感受态细胞,经检测诱饵质粒无自激活作用且诱饵基因对酵母细胞也无毒性作用。以P6基因为诱饵基因与NP69细胞酵母GAL4 AD融合c DNA文库进行酵母双杂交。经过多次营养缺陷培养基筛选、β-半乳糖苷酶印膜法和PCR鉴定排除假阳性结果,并通过回交实验再次验证,最后提取阳性质粒并进行碱基序列测定。测序结果经BLAST比对后,确定所筛选的同源基因编码产物。实验结果显示,P6蛋白与NP69细胞c DNA文库中的多个基因编码产物有相互作用,其中包括金属硫蛋白2A（M T2A）、分选连接蛋白（SNXs）、蛋白酶体激活因子PA28α亚基（PA28α）和干扰素γ。本研究成功利用酵母双杂交系统初步筛选出与不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6相互作用的配体蛋白,为进一步探究其生物学功能及分子行为奠定基础。