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肺癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,不管是发病率还是死亡率均位居恶性疾病前列,它的发生是多基因、多因素、多阶段相互作用的结果。参与肺癌发生过程的相关基因在正常组织和肺癌中的表达存在显著的差异,发现和研究这些肺癌差异表达基因不但有利于揭示肺癌发生发展的分子机制,而且还可为肺癌的诊断、治疗以及预防提供新的生物标志和靶点。Rap2b基因是最近运用抑制性消减杂交技术从中国人肺鳞癌高表达文库中筛选出的一个基因,它是ras癌基因超家族中的一员,并与之高度同源。以往研究显示多种肿瘤都存在ras的突变及过度表达。Ras基因影响下游效应因子多数是通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导系统,P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase, P38MAPK)是MAPK家族成员之一。因此,rap2b基因也可能在P38MAPK信号通路中发挥重要作用。目的该研究通过把pcDNA3.1-rap2b重组质粒转染NIH3T3细胞,并应用P38MAPK特异性抑制剂,以观察P38MAPK通路下游转录因子ATF-2的活化情况和rap2b基因在该通路中的作用,为探讨rap2b基因在人肺癌发生发展中的作用提供实验依据。实验方法1. pcDNA3.1-rap2b重组质粒及pcDNA3.1空质粒的提取用质粒提取试剂盒分别提取pcDNA3.1-rap2b重组质粒及pcDNA3.1空质粒,并进行初步鉴定。2.重组质粒的酶切鉴定对pcDNA3.1-rap2b重组质粒分别进行EcoRⅠ单酶切和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,1.0%琼脂糖凝胶电泳观察结果。3.PCR方法扩增rap2b基因以提取的质粒为模板,利用rap2b基因的上下游特异性引物进行PCR扩增,用1.0%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定,观察有无rap2b基因目的片段。4.重组质粒的测序鉴定经北京三博生物工程技术公司采用pcDNA3.1通用引物测定。运用BLAST软件,将rap2b基因序列与Genebank公布的对应序列进行比较分析。5.转染NIH3T3细胞将鉴定后去内毒素的质粒转染NIH3T3细胞中,48h和72h后分别从核酸和蛋白方面进行鉴定。6. P38MAPK抑制剂的应用转染前1h用P38MAPK抑制剂处理转染细胞,72h后从蛋白方面进行鉴定。7. Western-blot以正常细胞组作为对照,对转染空质粒细胞组、转染重组质粒细胞组、抑制剂+重组质粒细胞组测定磷酸化的和总的ATF-2蛋白表达,以了解rap2b基因在P38MAPK通路中所起的作用。结果1. pcDNA3.1-rap2b重组质粒的提取与鉴定挑取单菌落振荡过夜培养后提取质粒,进行鉴定。结果显示,EcoRⅠ单酶切产物长度为5.5kb左右,EcoRⅠ及XhoⅠ双酶切产物长度分别是5.5kb和0.629kb,和预期结果相同。用阳性质粒作为模板,用rap2b基因的特异上下游引物进行PCR扩增,扩增出大小为629bp的片段。经测序和序列分析,与Genebank公布的对应序列同源性为100%,证明是pcDNA3.1-rap2b重组质粒。2.转染NIH3T3细胞结果从细菌中提取去内毒素的质粒,用脂质体法将其转染进NIH3T3细胞中,通过RT-PCR进行mRNA的鉴定,扩增的目的条带与预期结果一致；提取蛋白后检测,转染pcDNA3.1-rap2b质粒的细胞表达RAP2B蛋白,转染pcDNA3.1质粒和空白对照组则没有表达。3. Western-blot结果对于ATF-2磷酸化蛋白表达,与正常细胞和转染pcDNA3.1空质粒细胞相比,转染pcDNA3.1-rap2b重组质粒的细胞表达上调(P<0.05),与转染pcDNA3.1-rap2b重组质粒的细胞相比,转染抑制剂+pcDNA3.1-rap2b重组质粒的细胞表达下调(P<0.05)。结论Rap2b基因激活了P38MAPK信号通路,使下游ATF-2蛋白的磷酸化上调,其在P38MAPK信号通路中发挥重要作用,可能为rap2b基因通过P38MAPK通路活化在分子水平参与肺癌的形成提供实验依据。