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孤独症(autism)是由多因素引起的以社会交往障碍、言语发育障碍、兴趣范围狭窄和刻板重复的行为方式为基本临床特征的严重神经精神障碍,一般在三岁之前发病。国外流行病学调查发现,孤独症在儿童群体中的患病率不低于1.3‰,男女比例约为4.3:1。近40余年来的研究证明孤独症是由多个基因相互作用引起的,遗传因素在其发病中起到主要作用的观点已得到越来越多的学者与临床医生的认可,但哪些基因与孤独症的发病相关尚不得而知。基于全基因组的连锁分析提示7号染色体长臂是重复性最好的和孤独症高度连锁的部位。本课题选择了该染色体上的两个基因RELN、GRM8,并运用病例对照方法对RELN、GRM8基因上的12个SNPs位点以及单体型和孤独症之间进行了关联分析,探讨RELN、GRM8基因是否为中国汉族儿童孤独症的易感基因。本次对RELN、GRM8基因和孤独症的相关性研究,为我们进一步明确孤独症发病的遗传学基础提供了客观依据,也为将来进一步研究孤独症的分子发生机制提供了方向。孤独症的复杂性状是导致基因连锁和相关分析结果不一致的一个重要原因,内在表型(endophenotype)的提出,使得组成遗传学上同质的人群用于基因的连锁和相关分析成为可能。在整个孤独症谱系障碍中,社会交往障碍是最具特色和核心的表现,许多高功能孤独症和Asperger综合征患者的智力可能并不低下,但在社会交往方面往往表现明显的沟通障碍。这意味着孤独症患者的社会认知功能可能存在着一个相对独立的神经机制和遗传背景。SRS(Social Responsiveness Scale)社会反应量表是迄今为止唯一可以被用来对孤独症特异社会化障碍严重程度进行量化评估的工具。本实验旨在通过运用SRS量表对孤独症患者、智龄匹配的唐氏综合征患儿和正常对照儿童进行SRS社会交往能力的评估并对结果进行分析,探讨在中国汉族孤独症患儿中,SRS社会反应量表所评估的结果是否也反映了孤独症谱系障碍特异的社会认知发展,孤独症固有的社会化障碍是否和文化、种族的差异无关,并有望被作为内在表型和基因进行连锁和相关性研究。第一部分儿童孤独症与RELN基因单核苷酸多态性的关联性研究方法:1、样本采集和基因组DNA抽提:按照国际疾病分类(ICD-10)和精神疾病诊断和统计手册(DSM-Ⅵ)诊断孤独症。选择孤独症患者213例,同时收集无神经系统疾患的正常血标本(对照组)160例。基因组DNA抽提采用氯化氨抽提法,保存备用。2、SNPs的选择和分型:利用生物信息数据库查找目的基因的多态性位点(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),共选取位于外显子、内含子和5’剪切部位上的8个SNPs位点(SNP1-SNP8);运用上海复旦的GenomelabSNPstream超高通量基因分型系统(Beckman Coulter)对所选SNPs进行分型。3、RELN基因和孤独症相关性的统计学分析:包括所测得基因型频率的Hardy-Weinberg在对照组中的遗传平衡检验;每一个SNP与孤独症之间在不同遗传模式下的相关性分析;不同SNPs标记之间的连锁不平衡分析;构建单体型,估算单体型频率以及不同单体型和孤独症的相关性分析。所有以上统计分析的显著性差异的P值水平为＜0.05。结果:1、单个SNP和孤独症的相关分析结果显示,位于RELN基因59号内含子部位的一个SNP(SNP2,rs736707)和孤独症存在显著的相关性(OR:0.72,95%CI:0.54-0.97.P=0.03),遗传模式为加性模式;2、根据连锁不平衡分析结果,构建了两个由相邻位点存在显著相关(D’＞0.75)的SNPs组成的单体型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4,SNP6/SNP7);3、不同单体型和孤独症的相关分析显示,包含有RELN基因59号内含子SNP位点的单体型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4)和孤独症显著相关(P=0.027)。结论:1、国内首次选取RELN基因作为侯选基因和汉族孤独症患儿进行关联研究,结果显示RELN基因59号内含子部位的一个SNP(SNP2,rs736707)与孤独症存在显著相关,遗传模式为加性模式。2、运用相邻SNPs构建了RELN基因上的两个单体型,其中一个单体型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4)和孤独症存在显著性相关,遗传模式为加性模式,这提示在跨越SNP1、SNP2、SNP3和SNP4区域或临近区域上至少有一个和孤独症相关的易感位点。3、RELN基因可能为中国汉族孤独症患儿的易感基因。第二部分儿童孤独症与GRM8基因单核苷酸多态性的关联性研究方法:1、样本采集和基因组DNA抽提:按照国际疾病分类(ICD-10)和精神疾病诊断和统计手册(DSM-Ⅵ)诊断孤独症。选择孤独症患者213例,同时收集无神经系统疾患的正常血标本(对照组)160例。基因组DNA抽提采用氯化氨抽提法,保存备用。2、SNPs的选择和分型:利用生物信息数据库查找目的基因的多态性位点(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),在GRM8基因3’端选取了3个SNPs,启动子部位选取了1个SNP共4个SNPs位点(SNP9～SNP12);运用上海复旦的Genomelab SNPstream超高通量基因分型系统(Beckman Coulter)对所选SNPs进行分型。3、GRM8基因和孤独症相关性的统计学分析:包括所测得基因型频率的Hardy-Weinberg在对照组中的遗传平衡检验;每一个SNP与孤独症之间在不同遗传模式下的相关性分析;不同SNPs标记之间的连锁不平衡分析:构建单体型,估算单体型频率以及不同单体型和孤独症的相关性分析。所有以上统计分析的显著性差异的P值水平为＜0.05。结果:1、单个SNP和孤独症的相关分析结果显示,GRM8基因上的4个SNPs位点和孤独症之间均未发现有显著性相关(P＞0.05);2、根据连锁不平衡分析结果构建了一个由相邻SNPs位点存在显著相关(D’＞0.75)的单体型(SNP9/SNP10/SNP11);3、单体型和孤独症的相关分析显示,单体型SNP9/SNP10/SNP11和孤独症之间不存在显著相关(P＞0.05)。结论:1、国内首次选取GRM8基因作为侯选基因和汉族孤独症患儿进行关联研究,结果显示4个SNPs中,均未发现与孤独症存在显著性相关。2、在GRM8基因3’端构建了一个单体型SNP9/SNP10/SNP11,未见其与孤独症存在显著性相关。3、GRM8基因可能并不是导致中国汉族儿童孤独症的易感基因。第三部分孤独症的社会化障碍分析方法:1、SRS社会反应量表的评估:对孤独症组、智龄匹配的唐氏综合征组和正常对照组儿童进行社会交往能力的评估,并得到一个单一的分值(包括粗分及标准分),分值越高,说明社会化障碍越严重。2、单因素方差分析(One-wayANOVA):当各组SRS得分均值之间存在显著性差异时,再进行Post-hoc两两比较,统计分析显著性差异的尸值水平为＜0.05。结果:SRS社会反应量表评估及统计分析结果:三组之间SRS评分均存在显著性差异(SRS粗分:F=149.57,P＜0.01;SRS标准分:F=106.11,P＜0.01);SRS粗分均值在三组之间的高低分布为:孤独症组(96.77±15.27)＞唐氏综合征组(60.17±18.85)＞正常儿童对照组(29.68±10.63)。Post-Hoc检验提示孤独症组、唐氏组和正常儿童对照组之间均存在显著性差异(P＜0.01);唐氏组和孤独症组之间也存在显著性差异(P＜0.01):SRS标准分均值在三组之间的高低分布为:孤独症组(80.92±8.15)＞唐氏综合征组(65.67±11.52)＞正常儿童对照组(49.32±5.70)。Post-Hoc检验提示孤独症组、唐氏组和正常儿童对照组之间均存在显著性差异(P＜0.01);唐氏组和孤独症组之间也存在显著性差异(P＜0.01)。结论:1、国内首次采用SRS社会反应量表对社交障碍表型进行量化评估,结果提示SRS量表的评估反映了汉族孤独症患儿特有的社交障碍。2、SRS量表评估所反映的孤独症患儿固有的社会化障碍不存在文化和种族上的差异。