脑卒中包括缺血性和出血性两种类型,是导致世界范围内死亡和致残的病因之一。出血性卒中是治愈率很低的一种卒中类型。发病率占所有卒中的10%~15%,而且30%的缺血性卒中要向出血性卒中转化。当血管破裂血液进入周围脑组织时发生脑出血(intrcerebral hemorrhage,ICH),ICH一个月内患者死亡率高达50%,幸存者经常遗留明显的残疾(88%),且神经功能恢复较差。临床上除症状严重并有手术指征者采取手术治疗外,一般以内科保守治疗为主。事实上,手术清除血肿及单纯使用细胞保护剂都不能充分地促进卒中后恢复。研究认为,多种细胞保护剂的联合应用或结合细胞保护剂和康复可能是更有希望的治疗策略,尤其对严重的损伤,联合治疗能使其达到最大的恢复。但适当的方法仍有争论。目前,针对运动功能损伤的康复治疗方法主要是运动训练,包括被动运动和主动运动。有充分证据说明,不同的康复干预可以促进大鼠缺血性卒中的恢复。即使简单的运动训练(exercise,EX)如,强迫性跑步也可以促进缺血性卒中的恢复,减少细胞死亡。但有关运动对脑出血方面的研究很少,临床研究认为卒中治疗单元(stroke unit,SU)对ICH病人有利,可降低死亡率并改善病人的预后,这得益于卒中单元的早期康复治疗。只要病人的意识状态不再恶化或血肿未破入脑室,被动运动活动均于发病后24h内开始,从而减少ICH病人的并发症,对运动功能预后有利。但什么时间开始主动的运动性功能锻炼,目前尚无明确定义。国外有几个实验研究认为康复也有益于ICH大鼠。其中一项研究结果显示,运动可以抑制血肿体积扩大,降低caspase-3的表达,增加齿状回细胞增殖,从而改善脑出血后神经功能恢复。但明确的恢复机制还不清楚,推测可能包括战胜习得性无用,促进皮层和皮层下再生,上调突触因子和血管因子等。不幸的是,大多数康复研究是检测由缺血或损伤引起的皮层病灶,很少有资料报道出血或皮层下损伤。国内至今尚未见相关报道。目前有4种ICH模型制作方法:①自体血注入脑出血模型;②胶原酶诱导ICH模型;③微球囊充胀ICH模型;④自发性ICH模型。在脑血管疾病实验研究中,脑出血模型一般多用脑内直接注血法,但对小动物来说,注血量、血肿大小与部位都难以控制,会使脑出血的实验研究受到一定限制。自Rosenberg等90年代介绍了一种脑内注射胶原酶诱发大鼠脑出血模型后,相关研究人员开始应用,认为此方法简单,模型稳定。实验研究表明,出血性脑损伤不仅由于血肿的占位效应及血肿对周围脑组织的直接破坏,继发性损伤也是出血性脑损伤的主要原因。而细胞凋亡机制参与了脑出血后继发性脑损伤。因此,本研究采用胶原酶诱导的脑出血大鼠模型,术后24h开始对其进行跑笼运动训练,然后于不同时间点观察其功能改善情况,以及运动对神经细胞凋亡及相关因子的影响,进而探讨运动促进出血性脑损伤功能恢复的机制。论文分四部分:第一部分研究采用胶原酶诱导法建立脑出血大鼠模型,同时对其行为学和组织学进行观察;第二部分是利用跑笼对脑出血大鼠进行运动训练,然后在不同时间点观察行为学变化;第三部分研究观察运动训练后血肿周围组织细胞凋亡以及海马区超微结构变化情况;第四部分研究观察运动训练对血肿周围组织细胞凋亡基因bcl-2、bax和caspase-3及其蛋白表达的影响。第一部分实验性脑出血动物模型的建立及其表现目的:建立稳定一致的脑出血大鼠模型,并观察其行为学及组织结构变化,为进一步研究运动训练对出血性脑损伤功能恢复的影响,及其作用机制研究作准备。方法:实验动物用健康雄性SD大鼠70只,体重270~300g,随机分为两组,实验组(n=35)和对照组(n=35),每组又分为术后6h,12h,24h,48h,72h,7d,14d共7个时相点,每个时相点5只。速眠新Ⅱ号(0.8-1.0ml/kg)右侧背部肌肉注射麻醉,俯卧位将大鼠头部固定在立体定位仪上,使前囟和后囟在同一平面上。头部去毛,消毒,于颅正中切开头皮约2cm,暴露颅骨和Bregma点。参考Rosenberg等方法,于前囟后1mm,中线向右旁开3mm处于颅骨上钻一直径约1mm的小孔(尾状核部位),深达骨膜,然后将含有0.5U胶原酶/2.5ul生理盐水微量注射器垂直固定在立体定位仪上,使针头与小孔在一条直线上,进针6mm(尾状核位置),然后缓慢推入脑内,注射完毕后,将针留置10min,然后将微量注射器缓慢退出,用医用石蜡封闭骨孔,并给动物编号。对照组为假手术组,操作方法同上,将微量注射器缓慢进入脑内,注射同等剂量的生理盐水,留针10min。在不同时间点观察其行为学改变,评定方法包括:Bederson评分;平衡木行走试验;肌力测验和前肢放置检测。之后断头处死,取出完整的脑组织,去除小脑、脑干及额极前部4mm脑组织,经脑表面穿刺点冠状切开标本,取穿刺点后约4mm的脑组织,放入4%多聚甲醛液中固定,标本依次梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋,在石蜡机上连续切片,片厚5μm,常规HE(苏木素-伊红)染色,用于组织学观察。取穿刺点前部的脑组织(厚约2mm)用来进行脑含水量的测定,切取的脑组织(病变同侧和对侧)立即放在准备好的同样大小和重量的铝箔纸上,分别称重(湿重)并记录,然后,放入烤箱,100℃,24h后,取出待测脑组织,恢复到室温后,称重(干重),反复称量至恒重。脑组织含水量即:(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。结果:模型成功率80%,术后6h大体形态可见明显出血灶,7d后血肿基本吸收。血肿直径约3.0-3.5mm,且不同时间点血肿大小、形态、部位相近;术后6h脑组织出现水肿,24h-72h达高峰,7d后明显减轻。出血早期光镜下可见神经细胞水肿、坏死,炎性细胞浸润,后期可见神经胶质细胞、胶质纤维增生;由于受麻醉剂的影响,术后6h两组大鼠均出现行为学改变,对照组术后24h后恢复正常,而实验组12h-72h有较明显的损伤,7d后虽有部分恢复,但术后7d-14d仍遗留部分缺损。结论:脑内注射胶原酶诱导脑出血模型,方法简单,成功率高,死亡率低,血肿形成稳定、一致,且有相应的病理改变和明显的行为学改变。第二部分运动训练对脑出血大鼠神经功能恢复的影响目的:探讨跑笼运动训练对脑出血大鼠神经功能恢复的影响。方法:90只SD大鼠随机分为运动组、对照组和假手术组,每组30只。前二组应用胶原酶诱导脑出血模型,假手术组用生理盐水替代胶原酶。运动组大鼠于脑出血后24h开始,由专人按运动训练时间表对大鼠进行训练。训练用跑笼为周长200cm、长50cm的圆柱形细钢丝网制滚筒,底座有一固定架,一端有一手摇柄,用手摇柄可控制其转动的速度,跑笼中间分为3格,可同时训练3只大鼠。2~14d,按4r/min速度转动转笼,每次40min,每5min休息2min,每天一次。第15～28天,跑笼内每隔50cm加一高1.5cm、宽1cm的木条,共4条,跑笼转速为5r/min。用于训练大鼠抓握、旋转及跑动。加障碍物后可训练大鼠进行跳越运动。对照组和假手术组大鼠不做运动训练,只限于笼内活动。分别于术后3d,7d,14d,21d,28d对大鼠进行姿势反射、平衡、肌力及前肢放置试验评估。同时进行大鼠体重测量。结果:术后24h运动组和对照组各功能损伤评定均无差异,但与假手术组差异显著(p<0.05)。Bederson神经功能评定:24h之后两组姿势反应逐渐恢复,直至术后21d完全恢复正常。虽然运动组比对照组有较好的恢复倾向,但无统计学差异(p>0.05)。平衡木行走试验:24h之后运动组开始改善,7d时改善显著(p<0.05),14d时恢复正常。而对照组功能恢复较慢,损伤持续到21d才恢复。肌力测验:运动组于术后72h开始恢复肌力,7d时较对照组改善明显(P<0.01),14d时恢复正常。而对照组术后28d时仍不能完全恢复正常。前肢放置检测:运动组大鼠72h开始出现功能改善,7d时改善明显,与假手术组和对照组均有统计学意义(P<0.01),14d时,与对照组比仍有差异,术后28d时基本恢复正常。而对照组恢复较慢,术后21d虽与假手术组无统计学意义,但仍有较明显的缺损。大鼠体重改变:术后24h三组大鼠体重无差异,72h时变化不明显,7d后实验组大鼠与对照组和假手术组比,体重明显减轻,尤其在术后7d。之后实验组大鼠体重逐渐增加,但仍与对照组和假手术组大鼠有明显差异(P<0.01)。对照组在术后7d-14d时也出现体重减轻,与假手术组相比差异有显著意义(P<0.01),21d时体重增加,基本恢复到假手术组水平(见Table 2 and Fig.5)。结论:早期(ICH后24h开始)运动训练可以改善脑出血大鼠的神经功能,至于开始运动训练的最佳时间有待于进一步研究。第三部分运动训练对脑出血大鼠血肿周围组织细胞凋亡和组织结构的影响目的:本研究旨在应用跑笼对脑出血大鼠进行运动训练,观察不同时间点血肿周围组织细胞凋亡和组织学改变,以及海马区超微结构方面的表现,以判断运动对出血性脑损伤细胞凋亡的影响。方法:实验动物用健康雄性SD大鼠110只,体重270~300g,随机分为三组,实验组(出血后运动n=50)和对照组(出血不运动n=50),假手术组(无出血不运动n=10),实验组和对照组又分为术后24h,7d,14d,21d,28d共5个时相点,每个时相点4只用于TUNEL和光镜检测,2只用于电镜检测,4只用于流式细胞仪检测。结果:(1)组织学改变:光镜下:ICH后24h实验组与对照组均有典型的ICH病理改变。但实验组各时间点在血肿周围组织、大脑皮层及海马区与对照组相比有明显的血管增生。电镜下:ICH 24h实验组和对照组血肿周围均可见明显的凋亡现象,运动干预后实验组海马区各时间点除突触前后膜模糊不清,少数细胞器轻度水肿外,未见明显凋亡及其他病理改变。而对照组改变相对明显,如神经元和胶质细胞胞浆肿胀,线粒体、高尔基体和内质网的扩张,血管周围及神经毡不同程度的水肿,ICH后7-14d还可见少数神经元、神经胶质细胞固缩,胞浆及核深染。假手术组光镜和电镜下结构基本正常。(2)凋亡检测结果:TUNEL阳性细胞数在ICH 24h时两组无区别,分别为88.0±15.7和91.0±16.9,与假手术组有明显差异(P<0.01),两组在ICH后7d- 14d凋亡一度表达下降,21d后开始回升,28d后又有下降趋势,但实验组表达明显低于对照组,差异有显著意义(14d P<0.01,21-28d P<0.05)。凋亡不仅存在于血肿周围组织和皮层,海马区也可见明显凋亡现象。(3)流式细胞仪检测结果:单参数分析PI法:凋亡率ICH后24h两组表达一致,无统计学差异,均高于假手术组。7-14d一度表现凋亡下降,21d回升,28d时又下降,变化趋势与TUNEL阳性细胞数一致。而且实验组明显低于对照组,差异有显著意义(P<0.05)。双参数分析AnnexinⅤ-PI法:变化趋势与单参数PI法一致,但凋亡率较PI更高。实验组明显低于对照组,差异有非常显著意义(P <0.01)。结论:运动训练可以抑制脑出血后神经细胞凋亡,增加血肿周围、大脑皮层及海马区血管再生,从而改善神经功能。第四部分运动训练对出血性脑损伤细胞凋亡基因bcl-2,bax和caspase-3及其蛋白表达的影响目的:观察运动训练对脑出血大鼠神经细胞凋亡基因bcl-2、bax和caspase-3及其蛋白表达的变化,从不同侧面探讨运动训练对脑出血后细胞凋亡的影响,并可望能为临床治疗提供依据和指导。方法:实验动物用健康雄性SD大鼠90只,体重270~300g。随机分为三组,实验组(出血后运动n=40)、对照组(出血后不运动n=40)、假手术组(无出血不运动n=10只)。试验组和对照组又分为术后7d,14d,21d,28d共4个时相点,每个时相点5只用于免疫组化检测,5只用于RT-PCR和Western blotting检测。试验组于术后24h开始跑笼训练,其余大鼠在标准笼内自由活动。结果:(1)免疫组化结果:bcl-2、bax和caspase-3阳性细胞表达均为细胞胞浆着棕黄色,阳性细胞主要分布于血肿周围和大脑皮层的神经元。实验组bcl-2于运动后21d表达开始上调,与假手术组差异明显p<0.01,28d时表达达高峰,与对照组和假手术组差异有非常显著意义p<0.01。实验组bax于运动后7d即开始下调,14d-21d下调明显,28d时虽有回升趋势,但仍与对照组和假手术组有显著差异p<0.05。实验组和对照组caspase-3表达均明显高于假手术组p<0.01,实验组似乎有轻度上调趋势,尽管28d时有下降迹象,但仍处于较高水平。对照组也有同样变化,虽然表达水平较实验组更明显,但两组差异无统计学意义p>0.05。(2)Western blotting结果:血肿周围组织Bcl-2,bax,caspase-3蛋白含量测定:用抗Bcl-2,bax单克隆抗体,抗caspase-3多克隆抗体进行Western blotting,Odessay western blotting分析结果显示,在分子量相当于26KD(bcl-2), 23KD(bax),32KD和17KD(caspase-3)的区域分别存在一蛋白带。实验组bcl-2 protein含量随运动时间延长,逐渐增加,28d时达高峰,且与对照组和假手术组相比差异有显著性意义p<0.05。7d-28d Bax蛋白含量基本处于一个相对稳定的低水平状态,对照组虽也有和实验组类似的变化,但表达量较低,两组差异有显著意义p<0.05。实验组与对照组相比,虽然Caspase-3蛋白含量各时间点都有下降趋势,但两组无统计学差异p>0.05。(3)RT-PCR结果:RT-PCR for Bcl-2:运动后7d时实验组、对照组和假手术组无差异,14d后表达量开始增加,21d-28d明显增加,与对照组相比差异有显著意义p<0.05;RT-PCR for Bax:在运动后7d时实验组与对照组和假手术组无差异,14d-28d表达降低,与对照组差异有显著意义p<0.05。RT-PCR for Caspse-3:在运动后7d-28d实验组与对照组相比表达无明显区别p>0.05。但两组与假手术组相比21-28d有显著差异p<0.05。结论:运动训练可以增加bcl-2基因及其蛋白表达,抑制bax基因及其蛋白表达,对caspase-3基因及其蛋白的抑制作用不明显。