一株鼠李糖乳杆菌所产新抑菌物质的分离、鉴定及其特性分析

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我国传统发酵食品中含有大量的乳酸菌,很多乳酸菌能够分泌产生一种或多种抑菌物质,包括具有抑菌活性的蛋白质、多肽类物质、还包括一些未知的小分子抑菌物质,因为它们所具有的安全性而成为新型的生物防腐剂研究的对象。本研究从一株由传统发酵食品中筛选出的LS-8乳酸菌的代谢产物中,分离纯化出抑菌活性强且具有广谱抑菌能力的物质,对该活性物质进行分离、鉴定以及部分理化性质研究,初步推导其抑菌机制。主要研究结果如下:(1)从一株由传统发酵食品中筛选出的鼠李糖乳杆菌LS-8的代谢产物中分离纯化具有抑菌活性的物质,采用乙酸乙酯萃取获得粗样,通过AKTA多肽柱纯化分离,再用HPLC纯化后获得纯品,并将该物质命名为LS-8-25。(2)通过MS和NMR对LS-8-25进行结构解析:LS-8-25的分子量为157.092 Da,由高分辨质谱的结果得出LS-8-25的分子式为C6H11N3O2,LC-MS的结果表明LS-8-25存在同分异构体,并且LS-8-25含有酰胺键,具有对称结构及含有烯醇互变。结合核磁共振谱推导其结构可能为以下两种情况:4,6-dimethyl-1,2,5-triazepane-3,7-dione:1H-NMR(500MHz,D2O),δ(ppm):1.33-1.35(d,6H,J=7Hz,-CH3),4.27-4.31(q,2H,J=7Hz,-CH-),4.7-5.0(m,3H,-NH-and D2O solvent residual signals);13C-NMR(125 MHz,D2O)δ(ppm):19.32,66.56,178.86;HRMS(ESI+)m/z calculated for C6H12N3O2[M+H]+158.0851,found 158.0923.4,6-dimethyl-1,2,5-triazepane-3,7-dione:1H-NMR(500MHz,D2O),δ(ppm):1.33-1.35(d,6H,J=7Hz,-CH3),4.27-4.31(q,2H,J=7Hz,-CH-),4.7-5.0(m,3H,-NH-and D2O solvent residual signals);13C-NMR(125 MHz,D2O)δ(ppm):19.32,66.56,178.86;HRMS(ESI+)m/z calculated for C6H12N3O2[M+H]+158.0851,found 158.0923.(3)对菌株Lactobacillus rhamnosus LS-8所产抑菌物质LS-8-25进行理化性质的分析:LS-8-25具有热稳定性,121℃下加热20 min未对抑菌活性产生显著影响。LS-8-25仅酸性条件下有抑菌活性,且在p H4.0时活性最好,随着p H升高,活性逐渐降低,p H≥7的条件下则失去活性。LS-8-25经过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和α-淀粉酶在37℃处理4 h后,活性并未显著降低。LS-8-25具有广谱抑菌能力,对常见的革兰氏阳性及阴性的食源性致病菌有抑制作用,且对食源性致病菌耐药菌株也有很强的抑菌效果。(4)采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对经LS-8-25作用后的敏感菌进行观察,初步显示敏感细菌的细胞膜遭到破坏,推断出LS-8-25的作用位点可能位于细胞膜上,作用机理可能是影响了细胞膜的电势。
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