热诱导FLP重组酶删除转基因油菜外源基因的研究

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随着植物基因工程研究的不断深入,人们越来越担心转基因植物是否会对环境带来诸如非靶生物效应、基因漂流、引发超级杂草、产生新病毒、使害虫产生抗性、标记基因对邻近基因表达的干扰及对人畜健康的危害等负面影响。为解决转基因植物对环境可能造成的威胁,本研究利用热激启动子Hsp18.2、FLP重组酶基因及其专一识别位点,构建了具有删除外源基因的热诱导植物表达载体。在烟草中验证了该系统对外源基因的删除作用。热激处理后转基因植株中FLP重组酶表达并识别两同向loxP-frf重组酶识别位点,使两位点间的DNA插入片段,(包括标记基因npt Ⅱ、报告基因gus、外源功能基因kn1)从转基因烟草基因组中删除,由kn1基因及gus基因引起的转基因烟草特殊表型消失。本研究亦将此热诱导重组酶基因删除系统应用于油菜基因工程改良,期望选育具有安全性的优良转基因油菜品种。研究结果如下: 1.重组酶系统的删除作用在模式植物—烟草上的验证 将含有35S:kn1表达元件的重组酶系统转化烟草,对转基因烟草植株热激处理。以组织化学染色分析删除效果,结果表明:171株转基因烟草热激后,其中64株没有再检测到GUS活性,且由kn1基因引起的叶片卷曲、叶柄短等表型消失,说明kn1基因和gus基因被删除。以重组酶基因flp设计引物进行PCR及RT-PCR检测,结果表明:未经热激处理的转基因植株和热激处理前转基因植株line 6、14均可扩增出特异条带,而热激处理后表型恢复正常的叶片未扩增出特异片段,说明flp基因也被删除,删除效率达到100%。 2.油菜再生体系及遗传转化体系的优化 以三个油菜品系X1335-1、特选4、黄籽526的子叶、下胚轴、花茎为材料进行了组织培养和遗传转化研究。筛选出最适分化培养基为:MS+3.0mg/16-BA+0.1mg/L NAA。摸索出农杆菌遗传转化的预培养、共培养时间,比较了不同基因型、不同外植体抗性芽诱导率。筛选出最佳生根培养基为:MS+2.0mg/L
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