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胚胎干细胞是一类具有在体外无限自我复制和分化为体内任何种类细胞的多潜能细胞。目前,公认的胚胎干细胞全能性判断标准包括:体内、体外向三胚层细胞分化和二倍体嵌合后能进入生殖脊。从1981年KaufmanMH等第一次分离小鼠胚胎干细胞至今,能满足这些标准的只有小鼠、大鼠和鸡的胚胎干细胞系。猪是重要的人类疾病模型动物、药物实验模型动物,同时还是人类异种器官移植的主要候选供体,其胚胎干细胞系的建立也一直受到广泛的关注,但是迄今为止真正的猪胚胎干细胞系(即满足上述判定标准)还未被建立起来。
本实验首先采用改进的方法建立了小鼠胚胎干细胞系,然后以小鼠胚胎干细胞系建立的技术体系为基础,通过对猪早期胚胎发育的研究,对猪胚胎干细胞的建系技术以及分离得到真正猪胚胎干细胞的可能性等问题进行了探讨。主要的实验方法和实验结果如下:
第一部分用KOSR胚胎干细胞培养液与FBS胚胎干细胞培养液结合的方式进行了ICR品系小鼠ESC的分离建系。结果表明,这种改进的建系方法不但可以用ICR品系小鼠的囊胚分离胚胎干细胞系,而且建系的效率高达71.4%。我们对得到的胚胎干细胞系中的一株进行了多能性的检测,实验数据表明该细胞系满足小鼠胚胎干细胞的鉴定标准。
第二部分我们对猪早期胚胎进行了收集、形态观察、直径测量等实验。通过实验,我们收集了关于猪早期胚胎发育的一些数据,统计数据表明,猪早期胚胎的胎龄和其直径大小具有正相关的联系;同一批次的胚胎之间发育不同步的现象比较普遍,所以用胎龄对猪早期胚胎进行笼统的划分是不科学的。
第三部分我们尝试了用猪体内、体外的胚胎进行分离胚胎干细胞的尝试。实验设计了三组培养液进行比较:KOSR胚胎干细胞培养液、FBS胚胎干细胞培养液、N2/B27胚胎干细胞培养液。统计结果表明,KOSR培养液更适合于体内胚胎分离胚胎干细胞。在优化的培养体系下,我们得到了人胚胎干细胞状的集落,并且传了三代。