影响产纤维素酶丝状真菌生长及蛋白合成分泌的转录调控因子的研究

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丝状真菌中的里氏木霉和草酸青霉,由于能够分泌大量木质纤维素降解酶,在工业生产纤维素酶或半纤维素酶领域得到了广泛的应用。外界环境信号,如碳氮营养的可利用性或离子浓度等,对丝状真菌的生长及木质纤维素降解酶的生产具有调控作用。而转录调控因子在丝状真菌响应外源信号、进而调控其菌体生长和蛋白合成分泌的过程中发挥着重要作用。本文分别对丝状真菌草酸青霉中的转录调控因子PrtT,里氏木霉的TrCrz1和Xyr1进行了功能研究,具体分为以下三个部分:  PrtT被报道在曲霉中是一种真菌特有的胞外蛋白酶基因的转录激活因子。我们同样发现草酸青霉prtT敲除子呈现出胞外蛋白酶活性显著降低的表型。在本研究中,我们通过RNA-seq测定表达谱并结合EMSA(Electrophoresis mobilityshift assay,凝胶阻滞实验)的方法,发现PrtT除了直接调控胞外蛋白酶羧肽基肽酶和天冬氨酸肽链内切酶基因的转录之外,还直接参与调控了胞外的二肽基肽酶编码基因dppV,胞内的三肽基肽酶基因以及5个淀粉酶基因,3个分别与麦芽糖、单糖、肽链转运相关的MFS(Major Facilitator Superfamily)转运蛋白编码基因的转录。另一方面,我们的研究还证实草酸青霉prtT敲除子在以酪蛋白为唯一碳源时,因为细胞呈现营养饥饿压力而间接影响多糖降解酶(如纤维素酶)以及大部分的铁离子或多种药物转运蛋白的编码基因的转录水平。这些结果加深了对丝状真菌中氮代谢和碳代谢调控系统相互作用的理解。  相比草酸青霉,里氏木霉在纤维素酶工业中的应用更为广泛,对其纤维素酶合成分泌调控机制的研究一直倍受关注。已知钙离子信号转导通路在调控酵母和曲霉属真菌的生长、孢子产生及渗透压敏感性方面起着举足轻重的作用。我们的前期研究发现在产酶诱导条件下添加适当浓度的Ca2+能够促进里氏木霉Rut-C30的纤维素酶产量。本研究的实验结果表明Ca2+通过一种依赖于钙调磷脂酶的方式显著地提高其菌丝生长、纤维素酶产量以及总蛋白的分泌量。进一步的分析发现Ca2+的添加会引起纤维素酶编码基因、转录激活因子xyr1以及几种内质网分子伴侣编码基因的表达水平显著上调。对里氏木霉中构巢曲霉CrzA的同源蛋白(TrCrz1)的功能鉴定结果表明TrCrz1可以直接和里氏木霉xyr1的上游启动子区结合,揭示了胞外添加的Ca2+可以通过Ca2+/CaM-Calcineurin-TrCrz1-xyr1-Xyr1-cellulasegenes的信号通路促进纤维素酶的合成与分泌,其中Xyr1发挥着传递钙离子信号的关键作用。  我们利用RNA-seq比较分析了里氏木霉出发菌株Rut-C30和xyr1敲除突变株X11在纤维素和葡萄糖条件下的表达谱,结果表明Xyr1不仅参与了胞外多糖降解酶(如纤维素酶)的表达调控,还参与调控了胞内的β-葡萄糖苷酶编码基因bgl2、纤维素进攻基因cip1、MFS乳糖转运蛋白编码基因、nmrA-like基因、endoT、酸性蛋白酶基因pepA和小热激蛋白编码基因hsp23的表达。这些结果揭示了里氏木霉的Xyr1在不同生命过程中发挥着多效调控作用,扩展了我们对其调控作用的认识。  综上所述,本论文对多个在丝状真菌的菌丝生长、木质纤维素降解酶的合成及蛋白分泌过程中起关键作用的转录调控因子进行了鉴定和功能分析。这些结果将有利于解析丝状真菌碳代谢和氮代谢的全局调控网络,并为进一步通过遗传改造获得高产木质纤维素降解酶的丝状真菌菌株提供理论依据。
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