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本研究旨在通过体外和体内试验研究内毒素(LPS)影响奶牛乳腺泌乳功能的分子细胞生物学机制。体外试验以荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究LPS对乳腺上皮细胞增殖、凋亡、乳脂肪合成、乳脂肪和乳蛋白基因表达以及表观遗传的影响;体内试验通过给荷斯坦奶牛饲喂不同营养水平和原料组成模式的日粮,研究乳腺组织表观遗传的变化。 试验一:以泌乳荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞形态的影响。生长培养基中分别添加0、1、2、4、16、64内毒素单位(EU)/mL的LPS,分别在培养24 h和48 h时,收集细胞对乳腺上细胞的增殖、细胞周期和凋亡进行测定。结果显示:(1)在培养24 h时,不同浓度LPS对乳腺上皮细胞增殖无显著影响,但有降低增殖率的趋势。48 h时低浓度(1、2 EU/mL)LPS仍有降低乳腺上皮细胞增殖率的趋势,但影响不显著;而16、64 EU/mL的LPS显著抑制了乳腺上皮细胞的增殖。(2)LPS可显著增加DNA合成前期(G0/G1期)和DNA合成期(S期)细胞所占比例并具剂量依赖性,减少DNA合成后期(G2/M期)细胞比例。(3) LPS处理24h时,4、16、64 EU/mL的LPS均可显著增加乳腺上皮细胞的凋亡率,其中64 EU/mL剂量组达到极显著水平,并使活细胞数极显著减少。处理48 h时,4 EU/mL LPS组细胞凋亡率显著增加,16、64 EU/mL的LPS使乳腺上皮细胞凋亡率极显著增加,活细胞数极显著降低。结果表明:(1)高浓度LPS可显著抑制乳腺上皮细胞的增殖。(2) LPS能扰乱细胞周期,使细胞周期发生紊乱,并使细胞主要停留在G0/G1和S期。(3)LPS可促进乳腺上皮细胞凋亡。 试验二:以泌乳荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成以及乳脂肪和乳蛋白合成相关基因表达的影响。分化培养基中分别添加0、1、2、4、16、64 EU/mL的LPS,培养24 h时,利用油红染色检测上皮细胞中乳脂合成状况,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测乳脂合成关键基因脂肪酸合酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸转运蛋白(CD36)、脂肪酸结合蛋白(FABP3)和乳蛋白合成相关基因κ-酪蛋白(CSN3)、β-酪蛋白(CSN2)、αs1-酪蛋白(CSN1S1)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)、信号转导及转录激活因子5(STAT5)的基因相对表达水平。结果显示:(1)64 EU/mL的LPS显著减少了细胞内甘油三酯(TAG)的含量。(2) LPS对FASN、SCD、CD36和FABP3基因表达无显著影响,可显著上调ACACA基因的表达水平。(3)LPS对CSN3、CSN1S1、MTOR、STAT5的基因表达无显著影响,但可显著下调CSN2基因的表达水平。结果表明:(1) LPS能显著抑制乳腺上皮细胞TAG的分泌。(2) LPS能上调ACACA基因表达水平。(3)高浓度的LPS可抑制β-酪蛋白基因表达丰度。 试验三:以荷斯坦奶牛泌乳期乳腺上皮细胞为模型,研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞组蛋白H3乙酰化和甲基化水平的影响。分化培养基中分别添加0、1、2、4、16、64 EU/mL的LPS,培养24 h时,提取细胞组蛋白和DNA,对奶牛乳腺上皮细胞组蛋白H3乙酰化和甲基化水平进行检测。结果显示:(1)低浓度(1、2、4 EU/mL)对乳腺上皮细胞组蛋白H3乙酰化程度的影响不显著,而高浓度(16、64 EU/mL)的LPS可显著降低乳腺上皮细胞组蛋白H3乙酰化程度。(2) LPS对αs1-酪蛋白和FASN基因甲基化程度均无明显变化。结果表明:LPS可降低乳腺上皮细胞组蛋白H3乙酰化程度,而对乳腺上皮细胞αs1-酪蛋白和FASN基因甲基化程度无显著影响。 试验四:选取30头第2胎泌乳中期中国荷斯坦奶牛作为试验动物,研究乳腺组织表观遗传的变化。试验牛分别饲喂三种日粮:(1)低精料混合粗饲料日粮(LMF);(2)高精料秸秆日粮(HCS);(3)低精料秸秆日粮(LCS)。试验结束后采取乳腺组织,提取乳腺组织组蛋白和DNA,检测组蛋白H3乙酰化和长链脂酰辅酶A合成酶1(ACSL1)、FASN、SCD以及核糖体S6激酶1(S6K1)与STAT5A基因的甲基化水平,并对组蛋白H3乙酰化水平和乳腺动脉血中LPS浓度进行相关性分析。结果显示:(1) HCS组乙酰化程度低于LMF组,LCS组乙酰化程度高于LMF组,但差异均不显著,而LCS组乙酰化程度显著高于HCS组。(2)乳腺动脉血中LPS含量与组蛋白H3乙酰化程度呈极显著的负相关(P=0.003)。(3)组蛋白H3发生乙酰化的位点是氮末端第5位赖氨酸(K5)与第7位(K7)。(4)各基因甲基化程度均不高且各组间差异均不显著。ACSL1、FASN、SCD基因的甲基化程度趋势均为LMF组<LCS组<HCS组;S6K1与STAT5A表现出与ACSL1、SCD、FASN相反的趋势(HCS组<LMF组<LCS组)。结果表明:(1)不同日粮模式可显著地影响乳腺组织组蛋白H3乙酰化程度。(2)不同日粮模式情况下,奶牛乳腺动脉血中LPS的含量与乳腺组织组蛋白H3乙酰化程度存在极显著的负相关。(3)不同日粮模式主要通过改变乳腺组织组蛋白H3K5乙酰化程度而影响乳腺组织组蛋白的乙酰化程度。(4)不同日粮模式对奶牛乳腺组织乳脂肪和乳蛋白合成相关基因甲基化程度无显著影响。