快速增长和肌肉增生型肉鸡品种的选育导致大量异质鸡胸肉的发生。其中,类PSE肉由于颜色苍白、质软、渗出率高严重影响消费者购买欲望;且由于蛋白变性导致的加工特性差、出品率低等问题给肉类加工业造成巨大损失。目前,研究人员普遍认为宰后初期较高的胴体温度,伴随着pH的快速下降是影响肉品质并诱发类PSE肉的直接原因。宰前应激会刺激动物机体神经-内分泌系统,影响免疫系统和生理代谢功能,造成宰后初期肌肉生理生化失调,也会对肉品质产生影响。因此,探究高温运输应激诱导肉鸡类PSE肉的形成机制具有重要意义。本研究首先研究不同高温运输时间对鸡肉品质的影响,探索诱导类PSE肉的运输时间;通过大批量采样验证该高温运输诱导时间,将鸡胸肉分类为正常肉和类PSE肉,测定肉鸡应激反应和能量代谢变化,并利用蛋白组学技术鉴定差异蛋白,进行生物信息学分析,寻找应激影响肉品质的关键调控蛋白;最后对这些蛋白进行验证并深入研究,阐明高温运输应激诱导类PSE肉和正常肉的形成差异机制。具体研究内容和结果如下:1.高温运输对肉鸡应激反应、肉品质及宰后肌肉能量代谢的影响选用105只42日龄AA肉鸡,随机分为5个处理组:对照组和不同运输时间组(0.5 h、1h、2 h和4 h)。每个处理3个重复,每个重复7只鸡。所有肉鸡(除对照组)在相同条件下进行运输。结果表明:随着运输时间的延长,血浆中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氩酶(LDH)活性逐渐增加。与对照组相比,胸肌中热休克蛋白70(HSP70)含量在0.5 h运输组中无显著变化,但运输时间超过1h组则显著升高(P<0.05)。运输时间超过2h会导致20-33%的肉鸡死亡率。此外,0.5 h运输导致鸡胸肉L*值、滴水损伤、蒸煮损失、AMP/ATP比例和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)表达量均显著增加,而pH24h值则显著降低(P<0.05),导致类PSE肉的发生。然而,其他运输组胸肌的肉色、滴水损失或蒸煮损失均无显著差异。随运输时间的增加,肌糖原含量逐渐降低,乳酸含量则呈现先上升后下降趋势。相关性分析结果表明肉品质与多数生化指标间均存在显著相关关系(P<0.05)。这些结果表明,高温运输会对肉鸡造成严重的影响。探究生理生化变化与肉品质间的关系有助于更好地理解应激影响肉品质形成的作用机理。2.高温短时间运输对肉鸡应激反应、肉品质及能量代谢的影响选用224只42日龄AA肉鸡,随机分为2个处理组:对照组(CON)和0.5 h运输组。每个处理16个重复,每个重复7只鸡。运输条件类似于第一章。按照正常肉(46<L*<53,5.7<pH24h<6.1)和类 PSE 肉(L*≥ 53,pH24h≤5.7)分类标准,发现类PSE肉发生率高达41.07%,将运输组中胸肌分成T-PSE和T-NOR组。分别从各组中选取8个样品进行血液指标和肌肉生化指标测定。结果表明:T-PSE组肉鸡血浆中CK和LDH显著高于CON和T-NOR组(P<0.05)。高温短时间运输导致肌细胞间隙增大,肌纤维直径减小。T-PSE组胸肌宰后初期(0.5-4 h)pH和糖原显著低于CON组,乳酸含量则显著高于CON组(P<0.05);T-NOR组与CON组差异不显著。此外,T-PSE组胸肌中(AMP+IMP)/ATP 比例、p-AMPK和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶表达量显著高于CON组和T-NOR组(P<0.05);糖酵解途径中己糖激酶、丙酮酸激酶和LDH在正常胸肌和类PSE胸肌间也表现出显著差异(P<0.05)。这些结果表明,肉鸡面对高温短时间运输表现出个体差异,而能量状态越低,AMPK激活程度越大,宰后糖酵解速率越快,进而更容易引发类PSE肉。3.高温短时间运输诱导的类PSE肉与正常肉中差异蛋白组学分析为进一步揭示高温短时间运输诱导类PSE肉和正常肉的差异及发生机制,选用第二章实验样品,利用相对和绝对定量同位素标记和多维液相色谱联用技术对类PSE胸肌和类正常胸肌进行差异蛋白组学分析。结果表明:与CON组相比,高温短时间运输诱发44个差异蛋白(P<0.05),T-NOR和T-PSE组中仅有5个相同蛋白,且同种差异蛋白在两种组中呈现相反趋势。T-NOR组与T-PSE组中共有39个蛋白表现出显著差异(P<0.05),这些蛋白生物功能主要是蛋白转运,信号传导,应激和防御,钙离子调控,细胞结构组分和能量代谢。通过生物信息学分析发现,糖酵解途径酶类、钙离子调控蛋白和分子伴侣等相关蛋白的差异表达在应激诱导类PSE肉的形成中起到潜在作用。采用荧光定量PCR技术对上述通路中涉及到的差异蛋白如β-烯醇酶、苹果酸脱氢酶1、肌钙蛋白C和HSP70等进行验证,结果表明转录水平与蛋白表达量相似。这些结果有助于理解机体面对应激时表现出的肉品质表型差异,也为下一步探究应激对肉品质影响的机理研究提供理论基础。4.高温短时间运输诱导的类PSE肉与正常肉中氧化还原状态和钙离子通道蛋白表达差异性比较为探究氧化还原状态和钙离子通道蛋白表达的差异与类PSE肉的联系,本部分实验主要比较高温短时间运输诱导的类PSE胸肌与正常胸肌中活性氧自由基(ROS)生成、脂肪和蛋白氧化、抗氧化性能指标、肌浆网钙泵(SERCA)和兰尼碱受体(RyR)表达量。结果表明:高温0.5 h运输导致ROS、硫代巴比妥酸和羰基含量显著增加,同时总抗氧化能力、总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性也显著升高(P<0.05)。而T-PSE组ROS生成量、脂肪和蛋白氧化程度显著高于T-NOR组,抗氧化性则显著低于T-NOR组。与CON组相比,高温短时间运输诱导正常胸肌中SERCA mRNA和蛋白表达量均显著升高,而类PSE胸肌则显著降低(P<0.05)。T-NOR组胸肌中αRyR、βRyR mRNA和αRyR蛋白表达量显著高于CON组和T-PSE组(P<0.05)。与CON组相比,T-PSE组胸肌中αRyR mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05)。这些结果表明,高温短时间运输诱导的氧化还原状态和钙离子通道蛋白表达的差异是造成肌细胞内钙离子紊乱的直接原因,而这进一步也会诱导类PSE肉的发生。5.高温短时间运输诱导的类PSE肉与正常肉中HSP70表达差异性比较及其结合蛋白的鉴定为探究HSP70表达差异影响肉品质形成的潜在机制,本部分实验主要比较高温短时间运输诱导的类PSE胸肌与正常胸肌中HSP70表达量、分布位置,以及鉴定其作为分子伴侣所结合得蛋白。结果表明:与CON组相比,T-NOR组胸肌中热休克转录因子1和HSP70 mRNA表达量显著增加(P<0.05),T-PSE组无显著变化。高温短时间运输诱导正常胸肌中HSP70蛋白表达量显著增加,类PSE胸肌中HSP70表达量则显著降低(P<0.05)。此外,T-NOR组胸肌中HSP70主要分布在细胞质中、且与细胞膜结合紧密;T-PSE组胸肌中HSP70则主要分布在细胞外基质和细胞膜表面。免疫沉淀实验表明胸肌中与HSP70结合的蛋白主要为分子伴侣蛋白、结构蛋白和糖酵解途径相关酶类,且在正常胸肌和类PSE胸肌中结合蛋白在含量和种类方面表现出一定差异。这些结果表明,应激条件下HSP70可能通过调控与其结合蛋白的功能特性来影响肉品质的形成。6.高温短时间运输诱导的类PSE肉与正常肉中HSP70和SERCA的关系探讨及Gln的干预作用为探讨HSP70和SERCA的关系,并探究应激条件下调控HSP70过表达对SERCA活性和肉品质的影响。本部分实验首先对比高温短时间运输诱导的类P S E胸肌与正常胸肌中SERCA活性,结果表T-明PSE组胸肌中SERCA活性显著低于CON和T-NOR组(P<0.05)。其次,通过体内和体外实验探究HSP70与SERCA的结合及其生物学意义。免疫沉淀和免疫荧光共定位结果均表明这两个蛋白在体内均存在一定程度的结合,且结合状态在不同肉品质表型胸肌中表现出一定差异;体外重组鸡HSP70能抑制高温(41℃和43℃)诱导SERCA活性的降低,但保护效率取决于高温应激强度以及持续时间。最后,通过腹腔注射谷氨酰胺(Gln)调控胸肌中HSP70表达,探究HSP70对高温短时间运输条件下肉品质的影响。结果表明高温短时间运输条件下腹腔注射Gln显著增加HSP70蛋白表达(P<0.05),进而降低ROS生成量及脂肪和蛋白氧化程度,抑制SERCA活性的降低,最终改善肉品质,降低类PSE肉的发生。综上所述:肉鸡面对高温短时间运输应激表现出不同的应激反应,生理生化变化包括能量代谢和糖酵解途径相关酶类、钙离子通道蛋白和HSP70和氧化还原状态的差异对类PSE肉的形成起到关键作用;应激条件下HSP70与SERCA的结合能维持肌细胞内钙离子的动态平衡;腹腔注射Gln诱导HSP70过表达能降低高温短时间运输诱导类PSE肉的发生。