茶渣是茶叶加工中的副产物,咖啡因的残留在很大程度上阻碍了茶渣的回收和利用。微生物法降解咖啡因被认为是茶渣处理的最有效方式,咖啡因诱导下合成某些特异蛋白使咖啡因降解菌具有高咖啡因胁迫抗性。寻找这些功能基因以探讨其在咖啡因降解中的作用,便成为微生物降解咖啡因研究的“钥匙”。为此,本研究基于咖啡因降解酶类诱导产生的本质,利用基于第二代测序技术的转录组测序技术得到咖啡因胁迫差异表达的基因,在咖啡因诱导表达基因中筛选与咖啡因降解代谢途径直接相关的功能基因。本研究对发掘咖啡因降解菌的酶系及功能基因资源,研制咖啡因降解成为主流代谢途径并高表达目标基因的工程菌制剂,实现微生物降解咖啡因的工厂化效率和规模具有十分重要的意义本研究首先对CF1菌株进行差异转录组测序,包括两个转录本(包括实验组和对照组);获得显著上调序列123条,显著下调序列2669条,其中Unigene1974_All(log2 Ratio=7.5)和 Unigene2111_All(log2Ratio=9.0)。对这两个差异序列进行了 GO 和 Pathway 的显著性富集分析,功能注释分别为甲基黄嘌呤N3-脱甲基酶和甲基黄嘌呤N-脱甲基酶电子转移蛋白。以Unigene1974_All和Unigene2111_All序列为参考序列,借助NCBI数据库相似菌株序列,通过特异性引物,获得甲基黄嘌呤N3-脱甲基酶cdnB和N-脱甲基酶电子转移蛋白cdnD基因全长。通过qRT-PCR检测cdnB和cdnD在实验组和对照组中的表达量,检测结果与差异转录组测序结果一致。分别通过Rosetta(DE3)-pET32a-cdnB和 Rostta-gami-pLysS-pET32a-cdnD 体系,成功表达 CdnB、和 CdnD 目标蛋白。在 CdnD存在下,CdnB具有以3-甲基黄嘌呤和3,7-二甲基黄嘌呤为底物时的N3-位脱甲基酶活性。