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研究背景：随着社会的发展和人民生活水平的提高,冠心病的发病率逐年上升,目前在我国乃至全世界范围内属于高发病率、高风险疾病之一。众所周知,动脉粥样硬化是冠心病发病的主要基础病变,而巨噬细胞泡沫化形成泡沫细胞,泡沫细胞内过多的胆固醇聚集则对动脉粥样硬化的发生、发展起到了决定性的作用。在动脉粥样硬化形成过程中,血液中的单核细胞与损伤的血管内皮细胞粘附,后者在单核细胞趋化因子等多种趋化因子的刺激下,迁移到血管内皮下,进一步转化为巨噬细胞,巨噬细胞吞噬大量氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),造成细胞内胆固醇代谢失衡,使细胞内大量胆固醇蓄积,最终泡沫化成巨噬细胞源性泡沫细胞。因此,泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化过程的关键环节。胆固醇外流即胆固醇逆转运能使泡沫细胞内过多的胆固醇排出,避免了细胞内过多胆固醇的蓄积,防止泡沫细胞的形成,预防动脉粥样硬化的发生。胆固醇外流主要通过三条转运途径来实现,其中三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)转运途径在胆固醇逆转运过程中起到了关键作用。其主要功能是促使细胞内胆固醇外流,与载脂蛋白A1结合,形成高密度脂蛋白(HDL),避免了胆固醇在细胞内的积聚。1999年,ABCA1基因首先在一种家族性疾病-Tangier病(高密度脂蛋白缺乏症)患者体内被发现,正是由于ABCA1基因突变,功能缺失,使胆固醇流出障碍,导致细胞内大量胆固醇蓄积,引发动脉粥样硬化的发生。因此,ABCA1具有抗动脉粥样硬化功能,对心血管系统具有保护作用。研究发现,许多炎症因子、自由基等各种危险因素造成血管内皮损伤后,不仅使单核细胞向巨噬细胞转变这一过程加速,增加巨噬细胞的吞噬功能,而且促使低密度脂蛋白(LDL)转变为ox-LDL,增加泡沫细胞的形成,导致动脉粥样硬化,造成血管内膜增厚,最终血管狭窄形成。但是否通过影响胆固醇逆转运途径来干预细胞内胆固醇代谢,进而影响巨噬细胞的吞噬功能,促使泡沫细胞形成数量增加,加速动脉粥样硬化的形成,其机制尚不明确。因此,研究这些损伤因素对泡沫细胞内胆固醇转运及转运途径的影响,有助于深入了解动脉粥样硬化的发病机制,对未来预防动脉粥样硬化的发生和发展具有重要意义。胱抑素C (CysC)是目前公认的动脉粥样硬化的独立危险因子之一,它是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员,它在1983年被美国科学家Anastasi[9]采用层析法从鸡蛋清中分离纯化首次获得,其分子量仅为13.3KD,属于小分子量低分子蛋白。最新的国内外的研究资料显示,CysC参与了心血管疾病的发生及发展过程,是目前研究较多的致动脉粥样硬化相关危险因子之一。Kestenbaum等研究发现,高CysC血症患者颈动脉内膜厚度明显高于血清CysC水平正常患者,而降低血清CysC水平后,颈动脉内膜增厚程度有所改善,由此认为,CysC参与了动脉粥样硬化的发生,持续高水平的血清CysC能够使血管内膜不断增厚。Fraley等研究发现,在高脂血症,LDL代谢紊乱的患者中,血清CysC水平明显升高,认为血清CysC水平与LDL浓度具有协同作用,并且具有正相关性,二者不仅共同参与了动脉粥样硬化的发生和发展,而且在加重了动脉粥样硬化的程度。我们曾研究了CysC在兔血管成形术后血管再狭窄形成过程中的作用,并对其作用机制进行了探讨。在实验过程中我们将48只新西兰大白兔随机分为损伤组(穿刺股动脉保留鞘管并行球囊损伤),治疗组(穿刺后行球囊损伤腹主动脉并局部注射CysC单克隆抗体干预)和对照组(穿刺股动脉,保留鞘管),每组各16只,分别于术前、术后不同时间段检测血清CysC水平。术后6周取腹主动脉并行HE染色、平滑肌肌动蛋白及增值细胞核抗原等免疫组织化学染色,测量血管新生内膜面积、血管腔面积、剩余狭窄率,并分析其与血清CysC水平的相关性。结果发现兔腹主动脉球囊损伤后血管粥样硬化发生,内膜出现增生,血管腔狭窄,同时血清CysC水平升高,二者呈正相关关系(P<0.01),经CysC单克隆抗体干预后,血清CysC水平下降,粥样硬化及内膜增生受到抑制,减轻了血管腔狭窄的程度。由此,我们认为,高CysC水平加速了动脉粥样硬化的进程,其加重血管狭窄,而CysC单克隆抗体则能拮抗CysC对动脉的损伤作用,延缓动脉狭窄,对血管起到了保护作用。CysC致动脉粥样硬化可能机制为：CysC的巯基在氧化过程中,产生了多种氧自由基,如过氧化氢、超氧化物阴离子等,可加速LDL的氧化,使LDL氧化成为ox-LDL,促使巨噬细胞吞噬大量的ox-LDL而泡沫化为泡沫细胞,参与动脉粥样硬化的发生、发展过程。对其致病机制,我们只是推论,并未深入研究。CysC是否通过对泡沫细胞的形成、细胞内胆固醇的代谢及转运蛋白ABCA1表达的影响,引起胆固醇代谢障碍,最终导致动脉粥样硬化的发生,这方面研究国内外罕见报道。本研究旨在通过探讨CysC对THP-1(人急性单核细胞白血病细胞株)源性泡沫细胞内胆固醇代谢及转运蛋白ABCA1表达的影响,研究其致病机制,为预防和治疗动脉粥样硬化提供理论基础。本实验分为两部分,第一部分为THP-1源性泡沫细胞的制备及鉴定,第二部分为CysC对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇代谢及转运蛋白ABCA1表达的影响。只有获得性质稳定的THP-1源性泡沫细胞,才能为后续的胆固醇逆转运及转运蛋白ABCA1表达的干预实验打下坚实的基础,第一部分重点探讨了THP-1源性泡沫细胞的制备过程,泡沫细胞的鉴定方法,包括佛波酯(PMA)诱导THP-1分化为巨噬细胞的最优条件及ox-LDL诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞的最佳诱导浓度和诱导时间等。第二部分将不同浓度的CysC与泡沫细胞共培养,同时加入CysC单克隆抗体干预,采用检测泡沫细胞内ox-LDL浓度、胆固醇含量及免疫荧光检测法测定泡沫细胞膜上转运蛋白ABCA1表达情况,探讨CysC对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇代谢及转运蛋白ABCA1表达的作用机制。第一部分THP-1源性泡沫细胞的制备及鉴定研究目的建立THP-1源性泡沫细胞的制备的最优条件及泡沫细胞的鉴定方法。研究方法1.主要溶液的配制方法,包括RPMI-1640培养基、考马斯亮蓝染液、PBS缓冲液、油红0液和苏木素液的配制。2ox-LDL的制备方法。3.THP-1细胞的培养方法。4.巨噬细胞的泡沫化。5.THP-1源性泡沫细胞制备过程及鉴定方法。研究结果1.50ng/ml的PMA诱导THP-1源细胞48h后形成典型的巨噬细胞(倒置显微镜下细胞成不规则状态,成多角形、棱形等,由悬浮状态变为贴壁状态)。2. 50ug/ml的ox-LDL诱导巨噬细胞48h后泡沫化为典型的泡沫细胞(胞浆成泡沫样改变,细胞内总胆固醇浓度增加,胆固醇脂占总胆固醇含量的60%以上)。研究结论THP-1源性泡沫细胞制备及鉴定过程操作简单,泡沫细胞模型稳定,实验方法科学、可靠,为后续的动脉粥样硬化的相关研究提供了良好的实验平台,打下了坚实的实验基础。缓冲液、油红0液和苏木素液的配制。2ox-LDL的制备方法。3.THP-1细胞的培养方法。4.巨噬细胞的泡沫化。5.THP-1源性泡沫细胞制备过程及鉴定方法。第二部分GysC对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇代谢及转运蛋白ABCA1表达的影响研究目的观察不同浓度CysC对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇代谢及转运蛋白ABCA1表达的影响。研究方法分为对照组和实验组,对照组为泡沫细胞组,不加入任何浓度的CysC干预。实验组加入一定浓度的CysC干预,按CysC浓度大小分为10ug/ml组、20ug/ml组、30ug/ml组、40ug/ml组、50ug/ml组和30ug/ml+CysC单克隆抗体组,分别将不同浓度的CysC与泡沫细胞共培养24h,行油红O液染色,泡沫细胞计数,ox-LDL酶联免疫反应试剂盒测定THP-1源性泡沫细胞内ox-LDL含量,胆固醇氧化酶终点检测法测定THP-1源性泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量,并用免疫荧光检测法对30ug/ml组和3Oug/ml+CysC单克隆抗体组测定泡沫细胞膜上转运蛋白ABCA1表达情况,同时与对照组比较。研究结果1.不同浓度CysC孵育THP-1源性泡沫细胞24h后,经油红O液染色,实验组内泡沫细胞形成增加,均高于对照组(P<0.05),但泡沫细胞形成数量不与CysC浓度成剂量依赖关系,30ug/mlCysC组泡沫细胞数量最多,40ug/mlCysC组和50ug/mlCysC组泡沫细胞数量较30ug/mlCysC组有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05),30ug/ml+CysC单克隆抗体组泡沫细胞数量较其他浓度组明显减少(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2,实验组泡沫细胞内ox-LDL含量增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),但其含量不与CysC浓度成剂量依赖关系,30ug/mlCysC组泡沫细胞内ox-LDL含量最多,40ug/mlCysC组和50ug/mlCysC组泡沫细胞内(ox-LDL含量较30ug/mlCysC组有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05),30ug/ml+CysC单克隆抗体组泡沫细胞内ox-LDL含量较其他浓度组明显减少(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.实验组泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),但其含量不与CysC浓度成剂量依赖关系,30ug/mlCysC组泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量最多,40ug/ml CysC组和50ug/mlCysC组泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量较30ug/mlCysC组有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05),30ug/ml+CysC单克隆抗体组泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量较其他浓度组明显减少(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.免疫荧光检测显示30ug/mlCysC组泡沫细胞ABCA1蛋白表达较对照组明显减弱(P<0.05),30ug/ml+CysC单克隆抗体组泡沫细胞ABCA1蛋白表达显著强于30ug/mlCysC组(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)研究结论1.CysC阻碍了THP-1源性泡沫细胞内胆固醇的外流,增加了细胞内胆固醇的聚集,促进了泡沫细胞的形成。2. CysC抑制THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白的表达。3. CysC可能通过抑制THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白的表达来阻碍细胞内胆固醇的外流。4. CysC单克隆抗体可促进THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白的表达,增加细胞内胆固醇的流出,减少泡沫细胞的形成,延缓动脉粥样硬化的发生、发展,这为将来研发降低CysC水平的相关药物来治疗心血管疾病提供了理论基础。