研究背景及目的:mTOR属于非典型丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,是一种高度保守的磷脂酰肌醇激酶相关激酶。在细胞中,m TOR以两种复合物的形式存在,即mTORC1及mTORC2。mTOR感知生长因子、营养和能量状态等信号,调节细胞生长、细胞存活、细胞活力、细胞增殖、自噬、生物大分子(包括蛋白质、核酸、脂质等)合成代谢等众多生物学过程。mTORC1调控蛋白质合成主要是通过其对4E-BP1/2、P70 S6K这两个主要底物的磷酸化,从而促进mRNA翻译。mRNA的翻译除了受到mTORC1的正性调控以外,mRNA翻译还接受MicroRNA(miRNA)的负性调节。miRNA是一类由内源基因编码的长度为21-25个核苷酸的非编码单链RNA分子,在细胞中经两次剪切形成成熟的miRNA,成熟的miRNA与Ago蛋白形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC能够与目标mRNA结合,通过Ago核酸内切酶活性直接降解靶mRNA、mRNA去腺苷酰化(deadenylation)以及直接抑制mRNA翻译等方式抑制mRNA翻译过程。在RISC中,Ago蛋白发挥中心作用。在哺乳动物细胞中,共有4个Ago分子,分别称为Ago1-4,其中,仅Ago2具有核酸内切酶活性,成为RISC直接剪切mRNA的重要分子。Ago2蛋白由四个主要结构域组成,即N端、piwi/Argonaute/zwille(PAZ)、Mid和PIWI结构域。PAZ和Mid结构域介导了与miRNA的结合。其中,miRNA的5’端与Mid结构域结合,而它的3’端则固定在PAZ结构域中。PIWI结构域具有核酸内切酶活性,这个结构域通过小干扰RNA(siRNA)或miRNA引导将靶RNA切割降解。但需要强调的是:在miRNA静默反应中,Ago2的每一个结构域都是必需的。Ago2的静默功能接受翻译后修饰的调控,其中磷酸化修饰是一种重要的调控方式。已有文献表明,Ago2 C端多个丝氨酸位点接受酪蛋白激酶(casein kinase)磷酸化,对某些mRNA装载到RISC中起到负性调控作用,但对miRNA进入到RISC中没有影响,从而调控某些基因静默效应。Ago2 387丝氨酸(S387)位点的磷酸化也已经被多个实验室的质谱分析所证实,但其生物学功能并没有得到完全阐述。利用Ago2体外激酶实验后的质谱分析发现Akt在体外可以介导Ago2 S387的磷酸化,但Akt是否在体内也具有磷酸化Ago2 S387的功能仍缺乏证据,而且Ago2 S387位点并不符合RxRxxS这个传统的Akt磷酸化底物的氨基酸识别序列,因此,究竟是哪一种蛋白激酶介导了Ago2 S387位点的磷酸化以及该位点磷酸化的生物学功能都有待深入研究。mTORC1是正性调控mRNA翻译的最重要蛋白激酶,而miRNA则是负性调控mRNA翻译的重要机制,那么细胞作为一个整体是如何协调mRNA翻译的这两种调控机制的呢?mTORC1是否有可能负性调控了mRNA静默功能呢?如果是,它的分子机制又是什么呢?而回答这些问题正是本课题的研究目标。研究方法:本研究首先采用了免疫共沉淀(Co-IP)和GST融合蛋白下拉(Pulldown)实验研究了Ago2与Raptor以及mTORC1其它组分之间是否存在结合,然后利用Ago2 S387位点特异性磷酸化抗体和Western Blot探究mTORC1是否磷酸化Ago2 S387位点,继而利用DNA定点突变技术获得Ago2 S387A和S387E的突变体,进而利用RNA免疫沉淀(RIP)方法研究了Ago2 S387磷酸化对Ago2结合RNA能力的影响。研究结果:1.Co-IP和Pulldown研究证实Ago2与mTORC1存在物理性结合。2.在利用各种不同细胞培养条件调节mTORC1活性的情况下,Ago2 S387位点磷酸化水平随mTORC1活性变化而变化,而与Akt活性变化没有相关性,从而证实Ago2 S387位点磷酸化是受mTORC1而非Akt调控。3.Ago2介导的RIP研究结果发现在mTORC1高度激活的TSC1基因敲除细胞中,与Ago2共沉淀的RNA明显降低,用雷帕霉素抑制mTORC1的活性之后与Ago2结合的RNA又有所上升;而Ago2 S387A、S387E突变体的RNA结合能力分别升高和减低。研究结论:mTORC1通过磷酸化Ago2的S387位点,调控Ago2的RNA结合能力,从而调控mi RNA静默效应。mTORC1活性越高,与Ago2结合的RNA含量越低,反之亦然。