目的:原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤,仅次于胃癌、肺癌,位列第三,是严重危害人类健康的重大疾病。然而,目前肝癌发病机理尚为完全清楚,临床上没有准确的早诊和治疗手段,这些成为肝癌研究中非常急迫的需要面对和解决的问题。而解决这些问题的关键环节之一,是理想肝癌模型的建立。尽管各种啮齿类肝癌动物模型已广泛应用于肝癌的发病机理及治疗的研究,但啮齿类动物模型的最大局限性在于与人类种属差异大、临床预测性差。而普通狨猴(commonmarmoset)是与人类亲缘关系较近的非人灵长类动物,具有体型小、性成熟早、繁殖快等特点;更为重要的是狨猴对肝癌表现出高度敏感性。用劳氏肉瘤病毒感染狨猴的肝脏,当肿瘤发展到2cm(小肝癌)时,会导致狨猴死亡,因此,狨猴在肝癌早期诊断、标记物筛选和发病机理及治疗研究方面表现出独特的优势。本课题利用天津医科大学特有的狨猴种群,通过表征、生理生化指标和行为学及肠道菌群检查,确立该种群的健康程度。利用化学药物诱导的方式获得诱导型狨猴肝癌模型,并通过血清学、影像学、免疫学和病理学等手段实时监测狨猴肝癌的发病过程,为肝癌的诊断、治疗及发病机理的研究创造了良好的平台----动物模型。同时,本课题对狨猴的胚胎发育展开初步的研究,为转基因型狨猴肝癌模型的建立提供了基础性数据。方法:1、通过表征、生化参数、传染病感染情况、消化道菌群和行为学特征监测等手段对笼养44年的狨猴和野生狨猴进行比较,以检测长期笼养对狨猴生化特点和行为学的影响,并以此确定该狨猴种群是否适用于肝癌模型的建立。2、手术方式及药物使用的优化:通过对大鼠分别切除不同尺寸肝脏包括1/3和2/3部分后,进行药物诱导,以比较不同切肝方式对大鼠的致死率;通过检测DENA(Diethylnirtosamine,二乙基亚硝胺,40mg/kg,每周 3 次)单独或者 DENA(20mg/kg)与 AFB-1(AflatoxinB1,400ug/kg,每周 3 次)联合给药两种方式对大鼠进行药物诱导,比较两种药物致死率和诱导效果。3、药物剂量优化:对两只成年狨猴进行切肝手术后,对其使用DENA进行诱导(每周3次),起始剂量为0.5mg/kg,每30天增加1mg/kg,并实时监测狨猴表征和病理变化以确定合适的诱导剂量。4、利用切肝手术方式获得狨猴新生肝;通过腹腔注射方式来化学诱导狨猴肝癌模型,选用的药物为DENA,使用剂量为2.5mg/kg,每周给药3次。5、采用影像学(超声、磁共振、小动物活体成像)、组织病理学(HE染色,纤维化染色、免疫组化)、免疫学、血清学等多种手段监测狨猴肝癌的发病过程,并与临床肝癌病人数据进行比较。6、利用放射免疫测定监测雌狨猴血清中黄体酮和雌二醇水平变化,以确定其生理周期;通过激素刺激超排和超声监测及手术吸取雌猴卵泡;振荡器刺激雄猴外生殖器刺激其排精;免疫荧光染色检测精子细胞膜完整性,台盼蓝染色计数,同时进行人工授精尝试。结果:1、长期笼养对狨猴的表征、体质、生化参数和肠道菌群及感染疾病的情况影响较小;但行为学变化较为明显,主要表现为领地意识和攻击性下降减弱;确定利用该狨猴种群建立狨猴肝癌模型的可行性。2、手术方式及药物的优化:大鼠上的实验结果表明:切除1/3肝脏的动物生存率要高于切除2/3肝脏,因此选择切除1/3部分为后续试验依据;药物比较试验显示:AFB-1毒害作用较大,动物容易出现鼻出血、腹泻、呕吐等急性中毒症状,甚至死亡;DENA能引起大鼠出现脂肪肝、炎症细胞、凋亡细胞、肝纤维化等类似肝癌病人的病理变化,满足诱导要求。3、药物剂量优化试验结果表明:0.5mg/kg和1.5mg/kg的DENA未引起狨猴的表征变化或者其他药物反应;2.5mg/kg DENA可以引起狨猴的肝损伤如病理分析出现炎症细胞、凋亡细胞,AST、ALT升高;虽然狨猴出现少量消瘦但未引起狨猴的急性中毒和死亡;给药剂量大于3.5mg/kg会引起狨猴腹泻,大于5.5mg/kg引起狨猴迅速消瘦、掉毛、黏膜变黑等急性中毒反应;6.5mg/kg会引起狨猴死亡。4、基于药物剂量优化的结果,选择2.5mg/kg,每周3次的DENA用量,狨猴未出现急性中毒死亡,但是出现与大鼠类似的肝损伤。5、在狨猴药物诱导过程中,发现术后和药物诱导初期的狨猴出现肝炎特征。建模过程中利用B超检测可见随着诱导依次出现肝肥大、肝脏表面粗糙、肝脏内血管增生、淋巴球聚集、类肿块暗区出现;小动物成像可见明显血管增生;磁共振成像技术检测可见肝脏肿瘤、完整肿瘤包膜;肝功能变化显示肝脏炎症,免疫测定显示CD细胞比例、TNF-α,IFN-Y变化趋势与临床病人数据类似;肝脏病理出现炎症细胞、凋亡细胞聚集,假小叶、肝纤维化等与病人类似病理状态;同时可见甲胎蛋白(alphafetoprotein)的高表达。6、经测定狨猴的生理周期为28-33天,与人类相似;黄体酮和雌二醇会在排卵前1-3天出现峰值;B超检测可以确定卵泡成熟状况和受孕情况,同时可以采用HCG等刺激雌猴超排;通过手术吸取卵泡和振荡器刺激获得卵母细胞和精子;采用免疫荧光染色、台盼蓝染色等进行精子分析和计数;精子经上浮优化后可以进行人工授精。结论:1、狨猴适合于长期笼养,其表征、血液生理生化参数、健康状态以及消化道微生物构成与野生型狨猴相比,无明显变化,适合于人类疾病包括肝癌模型的研究,但不适于行为学研究。2、切肝方式适用于狨猴,产生的新生肝对药物具有更高的敏感性;低剂量的DENA诱导体系适用于狨猴,未检测到急性的药物损伤和死亡。3、2.5mg/kg是兼顾诱导效果和狨猴安全的DENA剂量。4、化学诱导狨猴肝癌模型表现为典型的肝炎期、肝纤维化,肝硬化和肝癌阶段,与临床肝癌病人的发病过程相似,表明狨猴可以模拟人类肝癌发生的复杂性、异质性,同时检测到高表达肝癌特异性标志物甲胎蛋白。证明狨猴是理想的肝癌动物模型。5、初步建立了检测狨猴生理周期和收集卵子和精子的方法体系。