山药叶中迷迭香酸和黄酮苷元的提取分离与抗氧化活性研究

来源 :中国矿业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wuzhaoan
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我国约有2800年的山药利用历史。自21世纪初,全国山药种植面积稳步上升,山东、江苏、湖北、河南、山西、广西、河北7个省种植面积相继超过1万hm2。山药地上部分生长旺盛,多有分支,产量与地下块根相当,但是,作为山药种植的副产物,山药叶一般直接被废弃在田间,目前尚未见其他研究者关于山药叶活性物质方面的文献报道。笔者前期预实验发现山药叶富含迷迭香酸和黄酮等多酚类活性物质,具有很高的应用价值。如果能够将其中的有效成分提取与开发利用,不仅可以变废为宝,提高山药的综合利用率,又能开发新的植物资源。本文选择山药叶作为原材料,以迷迭香酸和黄酮苷元为研究对象,对其进行分离纯化,并对富集的迷迭香酸和黄酮苷元进行体外抗氧化活性的研究,得到如下结论:山药叶抗氧化活性显著强于其他部位,与其富含的多酚类化合物相关;进一步研究山药块根和茎叶中的多酚化合物,结果鉴定出29个酚类组分,其中5-O-咖啡酰奎宁酸、阿魏酰奎宁酸(tR:12.289)、迷迭香酸、芦丁和槲皮素为块根和茎叶共有组分。山药块根中除5种共有组分,还有芥子酸、丁香酸衍生物、花色苷等11种酚类组分,茎叶中另有咖啡酰奎宁酸甲酯、咖啡酰莽草酸、对香豆酰奎宁酸、香豆酰奎宁酸甲酯、山奈酚-3-O-芦丁糖苷等13种酚类组分。对9种山药叶中的主要多酚类化合物进行定量和聚类分析,结果发现9种山药叶中,迷迭香酸、芦丁、咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、对香豆酰奎宁酸和咖啡酰莽草酸含量差异较大,其中最为突出的是高迷迭香酸含量型和低酚酸高芦丁含量型两大类。以高迷迭香酸含量型山药叶为原料,应用Design-Expert 8.06.1软件对乙醇浓度、微波功率、微波时间和液料比4个参数进行四因素三水平的Box-Benhnken实验,对提取工艺进行响应面分析,得到最佳工艺为:乙醇浓度为60%(v/v),微波功率195 W,提取时间150 s,液料比30:1mL/g。聚酰胺初步纯化条件为:2.0 mg GAE/mL多酚粗提物溶液以1.5 mL/min的流速上样,上样结束后静态吸附4 h,3 BV蒸馏水洗脱,6 BV体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱。吸附分离后迷迭香酸含量由原来的8.57%提高到29.30%;对聚酰胺树脂富集物,用半制备液相色谱进行二级纯化并收集迷迭香酸样品,纯度达到98.15%。以低酚酸高芦丁含量型山药叶为原料,以80%甲醇酸溶液为溶剂,对盐酸浓度、微波处理温度和微波时间3个参数进行三因素三水平的CCD实验制备山药叶黄酮苷元,确定最优提取工艺为:盐酸浓度为为0.98M,微波处理温度为102℃,微波时间为120 s。D101大孔树脂分离纯化后山药叶黄酮苷元含量由粗提物的5.26%提高到65.30%,纯化物中槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量分别为36.10±3.12%、24.64±3.71%和4.57±0.53%。比较微波辅助提取酸水解同步法、微波辅助提取+微波酸水解法、微波辅助提取+水浴酸水解法和超声辅助提取酸水解同步法,发现微波辅助提取酸水解同步法所得残渣表面破裂最为彻底,黄酮苷元得率由大到小为:微波辅助提取酸水解同步法>微波辅助提取+微波酸水解法>微波辅助提取+水浴酸水解法>超声辅助提取酸水解同步法。考察微波辅助提取酸水解山药叶黄酮的动力学过程,推导了山药叶黄酮微波辅助提取酸水解过程的动力学模型为C=C0exp{-[exp(-(4324.1)/T+12.303)]t}该模型对微波辅助提取酸水解或微波辅助酸水解黄酮苷具有较为普遍的适用性,属于一个表观的一级动力学方程。山药叶提取物(10-100μg/mL)对正常脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的生长无影响,却能显著抑制肺腺癌细胞(A549)、结肠癌细胞(SW480)、乳腺癌细胞(MCF-7)等肿瘤细胞的生长。山药叶迷迭香酸与黄酮苷元富集物抗氧化活性显著增强,清除ABTS自由基活性显著强于Trolox,IC50值分别为0.083、0.087和0.254 mg/mL;但清除DPPH活性与总还原力较VC弱。通过研究迷迭香酸纯化物对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞氧化损伤的防护作用机制,发现其能够有效地促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时降低了促凋亡蛋白Bax的表达,提高Bcl-2/Bax比值,从而抑制氧化应激诱导的HUVECs凋亡;抑制H2O2引起HUVEC细胞NFκB和磷酸化NFκB表达的上调,同时抑制氧化应激诱导的促炎症因子的释放以及促进Nrf2表达。可见,山药叶迷迭香酸纯化物可以从不同角度对脐静脉内皮细胞起到了氧化应激防护的功效。
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