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目的:用转基因方法检测E-cad相关基因FAK与HDAC在SW579细胞中增殖的作用,以探讨shRNA其在甲状腺癌治疗中的应用价值。方法:第一章中将应用p LL3.7-FAK载体利用慢病毒转染系统感染SW579细胞株,并筛选出稳定转染的SW579-FAK细胞株。利用MTT法检测FAK基因过表达对细胞增殖的影响。构建pLKO.1-shRNA-FAK质粒。通过慢病毒转染系统将pLKO.1-shRNA-FAK质粒转染入构建好的SW579-FAK细胞株。利用qPCR技术和Western blot技术检测sh RNA对FAK表达抑制的效果,利用MTT法检测shRNA对细胞增殖抑制的效果。第二章中,将用qPCR和western blot法,检测SW579-FAK细胞株和shRNA-FAK细胞株中,肿瘤相关基因E-cad、MMP-2和MMP-9的表达情况。第三章中采用免疫组化检测甲状腺癌细胞SW579在移植裸鼠体内形成肿瘤后E-cad、MMP-2、FAK、MMP-9表达情况。通过Western blot技术,鉴定抑制FAK的表达对SW579细胞的转移及侵袭的影响情况,并观察分析甲状腺癌细胞SW579在裸鼠体内的瘤体生长情况以及成瘤率等有无明显差异。第四章中将采用RT-PCR技术筛选与甲状腺癌SW579细胞株放射敏感性相关的酶,并探讨筛选酶对SW579细胞株的放射敏感性,PCR技术分析shrna-hdac1,shrna-hdac2,shrna-hdac4的潜在影响,分析沉默酶shRNA增强甲状腺癌SW579细胞放射敏感性,荧光显微镜观察放疗后癌细胞的形态学特征。结果:1.RT-PCR以及Western blot检测技术在感染FAK shRNA的实验组中出现FAK表达下降(P<0.05),证实了在介导FAK沉默时,该目的基因能够得到稳定表达,而FAK稳定沉默,则说明成功建立甲状腺癌SW579细胞株。2.WB技术FAK基因抑制前后MMP-2、MMP-9、E-cadherin三个肿瘤相关基因蛋白层面表达的变化。SW579-FAK细胞组与FAK-shRNA空载质粒细胞组中E-cad基因蛋白表达相对于FAK-shRNA细胞组明显受到抑制。说明FAK过表达可以显著抑制E-cad基因的表达。FAK shRNA细胞组的MMP-9、MMP-2基因的表达水平较空载质粒对照组、SW579-FAK细胞组组显著降低,证明了 FAK可通过激活Ras信号通路,引起正常细胞癌变。3.裸鼠皮下移植实验成瘤率很高,结果为空质粒阴性对照组与FAKshRNA实验组及SW579-FAK组肿瘤生长大小有明显差异。FAK shRNA可明显抑制人甲状腺癌细胞的增殖情况。而小鼠体内成瘤实验证实shRNA可以通过抑制FAK基因的基因表达进而抑制肿瘤生长速度。4.SW579细胞经放射处理后,HDAC1、HDAC2、HDAC4和HDAC6的表达水平上调。HDAC质粒对SW579细胞具有抑制作用。其中,shRNA-HDAC1-NC、shRNA-HDAC2-NC、shRNA-HDAC4-NC 和shRNA-HDAC6-NC 的表达均明显高于 shRNA-HDAC1、shRNA-HDAC2、shRNA-HDAC4和shRNA-HDAC6质粒。HDAC系统的活化和FAK的过表达可以下调E-cad,提示两者对甲状腺癌的转移都可能通过E-cad实现。结论:1.感染FAKshRNA重组慢病毒组,能够建立稳定的甲状腺癌转基因细胞株。2.s RNA抑制FAK表达能够降低SW579的转移和表达速度。3.MMP-2、MMP-9蛋白表达较SW579-FAK组、阴性对照组明显降低,证实了 FAK可激活Grb2/Ras/MAPKs信号通道,调节MMP-s基因表达,从而为肿瘤细胞发生侵袭转移提供起始信号。4.shRNA-FAK实验组与空质粒阴性对照组及SW579-FAK组肿瘤生长大小有显著性差异,shRNA-FAK组成瘤较小。5.HDAC质粒对SW579细胞具有抑制作用。其中,shRNA-HDAC1-NC、shRNA-HDAC2-NC、shRNA-HDAC4-NC 和 shRNA-HDAC6-NC 的表达均明显高于 shRNA-HDAC1、shRNA-HDAC2、shRNA-HDAC4 和 shRNA-HDAC6 质粒。6.TSA和shRNAs池提高甲状腺癌细胞的敏感性SW579,并可以促进细胞凋亡。