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天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim)的块根中提取的一种蛋白质,为我国传统中药“天花粉”的有效成分,它具有引产、抗肿瘤和抗HIV病毒等多种生物学功能。TCS属于单链核糖体失活蛋白(ribosome inactivatingprotein,RIP),以往的研究主要集中在结构和药理作用方面,对其引起细胞凋亡和信号转导的分子机制研究得较少。为了更好地进行临床应用,有必要对天花粉蛋白的抗肿瘤作用机理进行深入研究。研究目的通过现代细胞和分子生物学的方法,深入研究TCS引起的肿瘤细胞凋亡和信号转导过程的规律,揭示其抗肿瘤作用的分子机理。研究方法第一部分:天花粉蛋白对肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的影响首先采用流式细胞术,以体外培养的鼠成纤维肉瘤细胞L929为对象,研究TCS对肿瘤细胞周期抑制作用;采用MTT法,在体外测定了TCS对Hela、Hep-G2、HCT116、Colo205等肿瘤细胞的细胞毒性。为了证实TCS引起细胞凋亡,利用Western blot方法检测了细胞凋亡过程中Caspase 3和其它信号分子如PARP和JNK的激活情况,以本实验室表达的TCS的类似蛋白PAP作为对照。第二部分:天花粉蛋白诱导细胞ER STRESS作用研究为了研究TCS引起的内质网应激(ER Stress)现象,首先采用Western blot方法检测了TCS引起的内质网应激标志蛋白CHOP和BIP的表达,以及CHOP诱导TRAIL受体蛋白DR5的上调情况;为了证明CHOP蛋白在TCS引起的细胞凋亡中的重要性,我们采用RNA干涉技术,将CHOP siRNA转染进入L929细胞中以将CHOP基因knock-down,观察转染前后细胞对TCS和TRAIL的敏感性的差异,用流式细胞术和MTT法测定TCS和TRAIL对上述两种细胞的协同杀伤作用。第三部分:AUTOPHAGY参与天花粉蛋白诱导的凋亡过程研究首先用Western blot方法,检测了TCS诱导细胞自噬的标志蛋白LC3的转化现象,再用双荧光蛋白标记的-LC3质粒转化进入细胞,并用激光共聚焦显微镜观测了TCS处理下自噬体的形成现象,以本实验室表达的PAP作为对照;为了进一步研究自噬在TCS诱导凋亡过程中的重要性,我们采用RNA干涉技术,通过siRNA转染来分别knock-down与细胞自噬相关的基因Atg 5、Atg 7和Beclin,用Westernblot方法证实其表达水平;最后,用流式细胞术测定Atg 5、Atg 7和Beclin基因knock-down细胞对用TCS和TRAIL处理的敏感性,来确定自噬过程对TCS引起的细胞凋亡的重要性。研究结果:第一部分:天花粉蛋白对肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的影响L929细胞经不同剂量TCS处理24 h后,有明显的G0/G1期阻滞,并呈时间和剂量的依赖性,而当处理时间增加到48 h后,高剂量组呈明显的S期细胞周期阻滞。MTT试验证实,TCS对各种肿瘤细胞呈现细胞毒性作用,各种肿瘤细胞对TCS处理的敏感性不同。用Hoechst 33342和Sytox Green染色经TCS处理的细胞可以在形态学上观察到细胞凋亡。TCS可以激活Caspase-3进而引起凋亡,PARP是Caspase-3的作用底物,因此能观察到PARP的的裂解,并呈时间和剂量依赖关系,对照蛋白PAP也有类似的作用。当培养基中加入泛Caspase抑制剂zVAD,可以完全阻断高剂量TCS处理Hela细胞引起的PARP的裂解,除见到PARP的裂解外,还可以见到Caspase-3酶原的激活和总JNK激酶的磷酸化激活。第二部分:天花粉蛋白诱导细胞ER STRESS作用研究TCS可以引起L929细胞的内质网应激,首先伴随着分子伴侣BIP的逐渐升高,在24 h小时后有内质网应激标志蛋白CHOP的明显表达,并观察到TRAIL受体DR5表达水平升高,Caspase 12酶原也是随着时间逐渐地被激活。因为TCS可以上调DR5的表达,所以在TCS和TRAIL联合应用时,呈现协同效应。用siRNA转染L929细胞后,CHOP基因knock-down细胞表现为对TRAIL和TCS联合处理的敏感性降低。第三部分:AUTOPHAGY参与天花粉蛋白诱导的凋亡过程研究微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3),是在真核细胞发现的自噬标志蛋白,Hela和L929细胞经TCS处理3-6 h,用Western blot可以见到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化;采用荧光双标记的LC3质粒可以检测到TCS或PAP处理后Hela、HepG2和L929细胞有明显的自噬体的形成现象。这些结果说明TCS引起的细胞凋亡过程伴随自噬的产生,PAP也有类似的作用。用MTT试验表明:溶酶体蛋白酶抑制剂氯喹可以协同TCS的细胞毒性,而自噬激活剂雷帕霉素可以拮抗TCS的细胞毒性。用siRNA干扰自噬基因Atg 5、Atg 7和Beclin。结果表明Atg 5和Beclin基因Knock-down细胞对TCS的敏感性显著增高,细胞毒性分别升高4.16和1.87倍,说明自噬在TCS引起的凋亡过程中起到保护细胞的作用。结论(1)发现天花粉蛋白可以抑制多种肿瘤细胞的生长,其抗肿瘤作用是通过双重机制即细胞周期阻滞和诱导凋亡来实现的;(2)天花粉蛋白可以引起明显的内质网应激,可以诱导CHOP蛋白和BIP蛋白的表达;(3)天花粉蛋白可以通过内质网应激,促进TRAIL受体DR5的上调,增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性;(4)天花粉蛋白可以引起细胞的自噬现象,蛋白酶抑制剂氯喹可以增加TCS的细胞毒性,自噬在天花粉蛋白诱导的凋亡过程中对细胞具有保护作用。(5)氯喹、TRAIL与TCS联合应用,可以增加TCS的抗肿瘤作用,具有潜在的临床应用价值。上述研究成果,为研究天花粉蛋白以及类似单链RIPs的抗肿瘤作用的分子机理提供了新的思路,具有理论意义和潜在的临床应用价值。