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目的：基于体外和体内实验，研究MOXD1基因在骨肉瘤增殖中的作用及可能的分子机制，为骨肉瘤的生物治疗提供新的思路及可能的分子靶标。
方法：
1、免疫组织化学法检测人骨肉瘤蜡块组织标本中MOXD1的表达情况。
2、q-PCR检测三株常用的骨肉瘤细胞株，根据MOXD1在细胞株中表达丰度的高低，选择表达丰度最高的两株细胞(U2OS、MNNGHOS Cl #5)作为实验细胞。
3、以MOXD1的基因序列为对应的模板，并设计RNA的相关序列，创建所需的载体，为后续的实验研究做准备。
4、借助RNAi载体，从而对骨肉瘤细胞进行基因敲减处理，构建MOXD1基因低表达骨肉瘤细胞模型。
5、qPCR检测在mRNA水平上MOXD1的敲减效率；Westernblot检测MOXD1内源性蛋白的表达量，确定敲减靶点的有效性。
6、细胞分组：(1)shCtrl组：正常的骨肉瘤细胞、加阴性对照病毒感染的骨肉瘤细胞组；(2)shMOXD1组：正常的骨肉瘤细胞、加MOXD1基因shRNA病毒感染的骨肉瘤细胞组。
7、celigo细胞计数法、MTT法检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞增殖状况的差异。
8、FACS细胞凋亡检测法检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞凋亡状况的差异。
9、克隆形成实验检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞增殖能力的差异。
10、选取20只裸鼠，随机分为两组，每组10只，并在裸鼠腋部皮下注射shCtrl组和shMOXD1组MNNGHOSCl#5骨肉瘤细胞悬液进行体内骨肉瘤模型构建，并检测MOXD1敲减前后移植瘤生长状况的差异。
11、选取shCtrl组和shMOXD1组的MNNGHOSCl#5细胞，分别提取TotalRNA，质控，利用基因芯片检测差异表达基因，q-PCR和Westernblot检测相关基因的表达差异情况，对差异基因进行生物信息学分析并探究与
MOXD1相关的细胞通路。
结果：
1、免疫组化检测显示，在人骨肉瘤标本中肿瘤组织内MOXD1的表达是明显增高的，在瘤旁和正常骨组织中出现了表达的下降甚至无表达。
2、RNAi慢病毒载体转染骨肉瘤细胞后，与shCtrl组相比，shMOXD1组两株骨肉瘤细胞中MOXD1基因的mRNA水平的表达量均受到了抑制(P＜0.05)，其中U2-OS细胞的敲减效率达到92.8%，MNNG/HOSCl#5细胞的敲减效率为71.0%。
3、与shCtrl组相比，shMOXD1组两株骨肉瘤细胞MOXD1的增值效率明显降低、发生凋亡的肿瘤细胞数量显著增多、骨肉瘤细胞形成的克隆形成数目减少(P＜0.05)。
4、在裸鼠体内成瘤实验中，与shCtrl组相比，shMOXD1组MNNGHOSCl#5骨肉瘤细胞形成异体移植瘤的裸鼠数量和肿瘤重量明显减小、活体动物荧光成像的荧光表达量降低(P＜0.05)。
5、基因芯片分析发现，在shMOXD1组中，上调了285个基因，下调了331个基因。MOXD1调控包括EIF2、ERK5和RAN在内的细胞通路，其中对EIF2细胞通路的抑制最为显著。
6、对与增殖及凋亡相关的37个基因进行q-PCR和Westernblot检测发现在shMOXD1组中PDGFRA,FOXM1,CCND3和TNFAIP2表达降低，EGR1表达升高。其中CCND3和TNFAIP2的表达显著降低，EGR1的表达显著升高。
7、选择和增殖相关的基因PCNA和cyclinD1以及和EIF2通路相关的基因(p-EIF2α、EIF2α、EIF4E、DDIT3和AKT1)进行Westernblot验证，发现上述基因均出现低表达。
结论：
1、通过RNAi慢病毒载体转染骨肉瘤细胞，成功构建了MOXD1低表达细胞模型。
2、MOXD1在人骨肉瘤石蜡标本中表达具有明显的肿瘤聚集现象，表达情况和患者性别、年龄、肿瘤发生部位无相关性，MOXD1的表达阳性率和肿瘤大小、Ennecking分期呈正相关，MOXD1在骨肉瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。
3、利用骨肉瘤细胞株MNNGHOSCl#5成功构建了骨肉瘤动物模型。抑制MOXD1可以有效的抑制骨肉瘤异体移植瘤的生长。
4、敲减MOXD1基因可以显著抑制EIF2细胞通路，导致骨肉瘤细胞增殖降低、细胞凋亡增加。
5、MOXD1基因在骨肉瘤中可能通过调节基因CCND3、TNFAIP2和EGR1的表达来发挥作用。
6、首次发现MOXD1在骨肉瘤中发挥着癌基因的作用。它可能成为骨肉瘤治疗的潜在靶点。
方法：
1、免疫组织化学法检测人骨肉瘤蜡块组织标本中MOXD1的表达情况。
2、q-PCR检测三株常用的骨肉瘤细胞株，根据MOXD1在细胞株中表达丰度的高低，选择表达丰度最高的两株细胞(U2OS、MNNGHOS Cl #5)作为实验细胞。
3、以MOXD1的基因序列为对应的模板，并设计RNA的相关序列，创建所需的载体，为后续的实验研究做准备。
4、借助RNAi载体，从而对骨肉瘤细胞进行基因敲减处理，构建MOXD1基因低表达骨肉瘤细胞模型。
5、qPCR检测在mRNA水平上MOXD1的敲减效率；Westernblot检测MOXD1内源性蛋白的表达量，确定敲减靶点的有效性。
6、细胞分组：(1)shCtrl组：正常的骨肉瘤细胞、加阴性对照病毒感染的骨肉瘤细胞组；(2)shMOXD1组：正常的骨肉瘤细胞、加MOXD1基因shRNA病毒感染的骨肉瘤细胞组。
7、celigo细胞计数法、MTT法检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞增殖状况的差异。
8、FACS细胞凋亡检测法检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞凋亡状况的差异。
9、克隆形成实验检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞增殖能力的差异。
10、选取20只裸鼠，随机分为两组，每组10只，并在裸鼠腋部皮下注射shCtrl组和shMOXD1组MNNGHOSCl#5骨肉瘤细胞悬液进行体内骨肉瘤模型构建，并检测MOXD1敲减前后移植瘤生长状况的差异。
11、选取shCtrl组和shMOXD1组的MNNGHOSCl#5细胞，分别提取TotalRNA，质控，利用基因芯片检测差异表达基因，q-PCR和Westernblot检测相关基因的表达差异情况，对差异基因进行生物信息学分析并探究与
MOXD1相关的细胞通路。
结果：
1、免疫组化检测显示，在人骨肉瘤标本中肿瘤组织内MOXD1的表达是明显增高的，在瘤旁和正常骨组织中出现了表达的下降甚至无表达。
2、RNAi慢病毒载体转染骨肉瘤细胞后，与shCtrl组相比，shMOXD1组两株骨肉瘤细胞中MOXD1基因的mRNA水平的表达量均受到了抑制(P＜0.05)，其中U2-OS细胞的敲减效率达到92.8%，MNNG/HOSCl#5细胞的敲减效率为71.0%。
3、与shCtrl组相比，shMOXD1组两株骨肉瘤细胞MOXD1的增值效率明显降低、发生凋亡的肿瘤细胞数量显著增多、骨肉瘤细胞形成的克隆形成数目减少(P＜0.05)。
4、在裸鼠体内成瘤实验中，与shCtrl组相比，shMOXD1组MNNGHOSCl#5骨肉瘤细胞形成异体移植瘤的裸鼠数量和肿瘤重量明显减小、活体动物荧光成像的荧光表达量降低(P＜0.05)。
5、基因芯片分析发现，在shMOXD1组中，上调了285个基因，下调了331个基因。MOXD1调控包括EIF2、ERK5和RAN在内的细胞通路，其中对EIF2细胞通路的抑制最为显著。
6、对与增殖及凋亡相关的37个基因进行q-PCR和Westernblot检测发现在shMOXD1组中PDGFRA,FOXM1,CCND3和TNFAIP2表达降低，EGR1表达升高。其中CCND3和TNFAIP2的表达显著降低，EGR1的表达显著升高。
7、选择和增殖相关的基因PCNA和cyclinD1以及和EIF2通路相关的基因(p-EIF2α、EIF2α、EIF4E、DDIT3和AKT1)进行Westernblot验证，发现上述基因均出现低表达。
结论：
1、通过RNAi慢病毒载体转染骨肉瘤细胞，成功构建了MOXD1低表达细胞模型。
2、MOXD1在人骨肉瘤石蜡标本中表达具有明显的肿瘤聚集现象，表达情况和患者性别、年龄、肿瘤发生部位无相关性，MOXD1的表达阳性率和肿瘤大小、Ennecking分期呈正相关，MOXD1在骨肉瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。
3、利用骨肉瘤细胞株MNNGHOSCl#5成功构建了骨肉瘤动物模型。抑制MOXD1可以有效的抑制骨肉瘤异体移植瘤的生长。
4、敲减MOXD1基因可以显著抑制EIF2细胞通路，导致骨肉瘤细胞增殖降低、细胞凋亡增加。
5、MOXD1基因在骨肉瘤中可能通过调节基因CCND3、TNFAIP2和EGR1的表达来发挥作用。
6、首次发现MOXD1在骨肉瘤中发挥着癌基因的作用。它可能成为骨肉瘤治疗的潜在靶点。