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嗜盐古菌是古菌域中一类喜好高盐的微生物，广泛分布于各种高盐环境中。嗜盐古菌所分泌蛋白酶因其耐盐碱、耐高温和耐有机溶剂等性质，具有优良的应用潜力和重要研究价值。盐渍海带作为一种高盐市售食品，其中含有丰富多样的嗜盐古菌和高产胞外蛋白酶菌株资源。本文针对产自4个不同沿海地区的盐渍海带，从高通量测序、嗜盐古菌分离、产胞外蛋白酶菌株筛选、多相分类学鉴定、基因组测序、疑似蛋白酶基因功能验证与蛋白酶的异源表达和纯化、酶学性质表征等方面开展研究，聚焦盐渍海带中嗜盐古菌的多样性、产胞外蛋白酶新种的特性与分类学地位、嗜盐蛋白酶酶学性质以及嗜盐蛋白酶C端延伸区（C-terminal extension，CTE）结构域功能，以期为产嗜盐蛋白酶菌株与嗜盐蛋白酶的开发利用提供科学依据。
首先，以辽宁大连（DLLS）、山东荣成（RC）、江苏连云港（LYG）、福建霞浦（XP）生产盐渍海带为研究对象，通过高通量测序分别获得154、152、139和61个OTU。从DLLS样品分离获得85株嗜盐古菌分属于15个属的25个种，从RC样品分离获得87株嗜盐古菌分属于14个属的29个种，从LYG样品分离获得83株嗜盐古菌分属于13个属的25个种，从XP样品分离获得96株嗜盐古菌分属于4个属的18个种。不同地区产盐渍海带嗜盐古菌群落结构存在差异，免培养和可培养多样性结果表明大连产盐渍海带蕴藏的嗜盐古菌多样性最高。采用牛奶平板法筛选产胞外蛋白酶菌株，共筛选到产酶菌株116株，分属于12个属。
其次，基于表型特征、化学组分、系统发育、基因组分析的多相分类学研究结果表明，菌株DLLS-82T、LYG-36（Halorussus salsus sp.nov.）和RC-68T（Halorussus rufus sp.nov.）为Halorussus属的2个新种；菌株DLLS-108T（Halostella pelagica sp.nov.）和DL-M4T、LYG-109（Halostella litorea sp.nov.）为Halostella属的2个新种。
再次，针对产蛋白酶的新种菌株RC-68T和DL-M4T进行全基因组学研究，分别注释到7个（HrshlyA?G）和3个（HslhlyA?C）丝氨酸蛋白酶基因。将它们在不产胞外蛋白酶的Haloferax volcanii H1424中表达，利用四种蛋白底物（脱脂牛奶、明胶、偶氮酪蛋白和四肽底物）验证疑似蛋白酶基因功能。结果表明HrsHlyC、HrsHlyD、HrsHlyE、HrsHlyF、HrsHlyG、HslHlyA和HslHlyB具有蛋白酶活性，而HrsHlyA、HrsHlyB和HslHlyC无水解能力。对蛋白酶HslHlyB的CTE的截短和替换实验证明CTE对维持嗜盐古菌分泌的蛋白酶活性十分重要，同时确证了CTE结构域在嗜盐古菌蛋白酶之间的可替换性。
最后，将HslhlyB和HslhlyBΔCTE利用Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌诱导表达，经纯化复性获得纯酶。嗜盐蛋白酶HslHlyB和HslHlyBΔCTE分子量分别为42kDa和20kDa，最适催化反应条件为50?C、pH8.5、NaCl3.5M和50?C、pH7.5、NaCl3M，都具有良好的热稳定性、pH稳定性和高盐浓度的稳定性，以及广泛的底物特异性，属于金属离子依赖的丝氨酸蛋白酶。HslHlyB和HslHlyBΔCTE对甘油、DMSO、PEG600、K+、Mg2+、Ca2+和Sr2+有良好的耐受性。比较HslHlyB和HslHlyBΔCTE的性质表明CTE结构域并不是蛋白酶自催化成熟所必须的，但会影响酶的催化性质，同时CTE结构域有助于促进酶与大分子蛋白底物的结合。蛋白酶HslHlyB和HslHlyBΔCTE水解大豆分离蛋白的水解液肽谱显示，经HslHlyBΔCTE水解后肽段平均分子量更小、肽链平均长度更短。因此，嗜盐蛋白酶有望应用于高盐食品（如酱油）的加工。
首先，以辽宁大连（DLLS）、山东荣成（RC）、江苏连云港（LYG）、福建霞浦（XP）生产盐渍海带为研究对象，通过高通量测序分别获得154、152、139和61个OTU。从DLLS样品分离获得85株嗜盐古菌分属于15个属的25个种，从RC样品分离获得87株嗜盐古菌分属于14个属的29个种，从LYG样品分离获得83株嗜盐古菌分属于13个属的25个种，从XP样品分离获得96株嗜盐古菌分属于4个属的18个种。不同地区产盐渍海带嗜盐古菌群落结构存在差异，免培养和可培养多样性结果表明大连产盐渍海带蕴藏的嗜盐古菌多样性最高。采用牛奶平板法筛选产胞外蛋白酶菌株，共筛选到产酶菌株116株，分属于12个属。
其次，基于表型特征、化学组分、系统发育、基因组分析的多相分类学研究结果表明，菌株DLLS-82T、LYG-36（Halorussus salsus sp.nov.）和RC-68T（Halorussus rufus sp.nov.）为Halorussus属的2个新种；菌株DLLS-108T（Halostella pelagica sp.nov.）和DL-M4T、LYG-109（Halostella litorea sp.nov.）为Halostella属的2个新种。
再次，针对产蛋白酶的新种菌株RC-68T和DL-M4T进行全基因组学研究，分别注释到7个（HrshlyA?G）和3个（HslhlyA?C）丝氨酸蛋白酶基因。将它们在不产胞外蛋白酶的Haloferax volcanii H1424中表达，利用四种蛋白底物（脱脂牛奶、明胶、偶氮酪蛋白和四肽底物）验证疑似蛋白酶基因功能。结果表明HrsHlyC、HrsHlyD、HrsHlyE、HrsHlyF、HrsHlyG、HslHlyA和HslHlyB具有蛋白酶活性，而HrsHlyA、HrsHlyB和HslHlyC无水解能力。对蛋白酶HslHlyB的CTE的截短和替换实验证明CTE对维持嗜盐古菌分泌的蛋白酶活性十分重要，同时确证了CTE结构域在嗜盐古菌蛋白酶之间的可替换性。
最后，将HslhlyB和HslhlyBΔCTE利用Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌诱导表达，经纯化复性获得纯酶。嗜盐蛋白酶HslHlyB和HslHlyBΔCTE分子量分别为42kDa和20kDa，最适催化反应条件为50?C、pH8.5、NaCl3.5M和50?C、pH7.5、NaCl3M，都具有良好的热稳定性、pH稳定性和高盐浓度的稳定性，以及广泛的底物特异性，属于金属离子依赖的丝氨酸蛋白酶。HslHlyB和HslHlyBΔCTE对甘油、DMSO、PEG600、K+、Mg2+、Ca2+和Sr2+有良好的耐受性。比较HslHlyB和HslHlyBΔCTE的性质表明CTE结构域并不是蛋白酶自催化成熟所必须的，但会影响酶的催化性质，同时CTE结构域有助于促进酶与大分子蛋白底物的结合。蛋白酶HslHlyB和HslHlyBΔCTE水解大豆分离蛋白的水解液肽谱显示，经HslHlyBΔCTE水解后肽段平均分子量更小、肽链平均长度更短。因此，嗜盐蛋白酶有望应用于高盐食品（如酱油）的加工。