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目的先天性小睑裂综合征(BPES),是一种较罕见的先天性常染体显性遗传疾病,其眼部典型临床表现以睑裂狭小、上睑下垂、反向内眦赘皮、内眦间距增宽为特征。该综合征分为两种亚型：Ⅰ型,外显率100%,由父亲传代,女性患者不育；Ⅱ型,外显率96.5%,父亲、母亲传代机会均等,男女患者均只累及眼部而可以生育。FOXL2基因是BPES首位致病候选基因。FOXL2基因突变是如何影响其转录功能导致BPES发生的具体分子学机制尚未明确,是目前BPES研究的热点。本研究收集了两个BPES家系,进行临床表型和遗传规律分析。检测候选致病基因FOXL2突变位点,运用生物信息学对突变FOXL2基因进行功能预测,并观察突变基因在体外细胞中的表达和功能改变,探索突变型FOXL2导致BPES发生的可能机制。方法1本研究收集了就诊于浙江大学医学院附属第一医院眼科的两个BPES家系。家系成员接受病史调查和眼科检查,进行临床表型和遗传规律分析。2抽取家系成员和正常对照者外周血,提取DNA,应用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术对FOXL2基因进行突变位点检测。应用焦磷酸测序技术对突变位点杂合子含量进行定量检测,分析其与表型轻重的关系。应用生物信息学方法预测FOXL2基因突变对蛋白质结构和功能的影响。3利用重组DNA技术克隆至真核表达载体pEGFP-N1,构建野生型和突变型基因质粒,转染COS7细胞后观察蛋白亚细胞定位；同时克隆至载体pCDB,质粒构建成功后转染HEK-293细胞后应用RT-PCR测定其对靶基因OSR2的调控改变结果1家系一4代均有发病,符合BPESI临床诊断者6例,男3例,女3例。家系二3代均有发病,其中BPES患者7例,男4例,女3例。除了家系一中患者Ⅲ：2表现为轻度上睑下垂,反向内眦赘皮不明显,其他所有患者均有明显的睑裂狭小、上睑下垂、内眦间距增宽以及反向内眦赘皮表现。家系二中有一例女性患者未婚,其余女性患者均能生育。两个家系患者诊断均符合BPESII型,遗传方式符合单基因常染色体显性遗传方式。2测序结果：家系一发现FOXL2基因的模板链中第162位碱基出现一杂合峰,鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶(c.162G>D,密码子由AAG突变为AAT,第54位的赖氨酸突变为天冬酰胺(p.Lys54Asn)。家系二发现FOXL2基因的模板链中第308位碱基出现一杂合峰,鸟嘌呤突变为腺嘌呤(c.308G>A),密码子由CGC突变为CAC,第103位的精氨酸突变为组氨酸(p.Argl03His).均为首次报道的新突变位点。焦磷酸测序结果：家系一中患者Ⅲ：2突变位点杂合子含量中突变碱基的含量低于正常碱基的含量,其他患者突变位点杂合子含量中突变碱基的含量高于正常碱基的含量。生物信息学分析软件预测提示FOXL2(c.162G>T)和FOXL2(c.308G>A)两突变对蛋白质结构无明显影响,但有可能造成蛋白亚细胞定位异常和损害其功能。3成功构建携带野生型FOXL2基因的质粒pEGFP-N1-FOXL2WT,以及携带C.162G＞T突变型FOXL2基因质粒pEGFP-N1-FOXL2-MUT1,和c.308G>A突变型FOXL2基因质粒pEGFP-N1-FOXL2-MUT2。转染COS7细胞后发现野生型FOXL2蛋白定位于核内,c.162G>T突变FOXL2蛋白和c.308G>A突变FOXL2蛋白也表达于核内,胞浆内无表达。成功构建携带野生型FOXL2基因的质粒pCDB-FOXL2WT,以及携带c.162G>T突变型FOXL2基因质粒pCDB-FOXL2-MUT1,和c.308G>A突变型FOXL2基因质粒pCDB-FOXL2-MUT.转染HEK-293细胞后,野生型FOXL2促进细胞中OSR2mRNA含量较空载体明显增多,差异具有统计学意义。而c.162G>T突变FOXL2和c.308G>A突变FOXL2转染细胞中的OSR2mRNA含量与野生型FOXL2相比明显减少,差异具有统计学意义。结论1本研究发现了两个导致BPESII型的FOXL2错义突变：c.162G>T和c.308G>A,均为首次报道的新突变位点。2家系一患者Ⅲ：2的眼部畸形表现比较轻可能与突变位点杂合子突变碱基的含量低于正常碱基的含量有关。3c.162G>T突变型FOXL2基因和c.308G>A突变型FOXL2基因编译蛋白其结构预测与野生型FOXL2蛋白没有明显差异,同时亚细胞定位都位于核内,但该两突变降低OSR2基因的表达,推测本研究两个家系FOXL2突变可能通过降低对靶基因OSR2的调控作用,从而导致BEPS的发生。4本研究扩宽了BPES的基因突变谱,同时揭示了突变基因导致BPES发生的可能机制,为先天性小睑裂综合征的进一步研究提供依据。