KBN微乳、微乳凝胶的制备工艺及其对小鼠VVC模型药效研究

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目的:
  KBN处方为外治外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal Candidiasis,VVC)的临床验方,制成常规溶液型或乳剂型洗剂载药量低,且对方中有效成分小檗碱及茶树油溶解性差,未能充分发挥处方优势而影响疗效。微乳、微乳凝胶作为一种新型药物载体,载药量高且对难溶性药物具有较好的溶解能力。基于此,本课题制备可同时承载黄连生物碱与茶树油的KBN微乳及微乳凝胶,考察其理化性质及体外释药行为,并通过建立小鼠VVC模型评价其药效,将传统中药方剂与现代制剂结合,以期实现临床验方最佳药效。
  方法:
  1.KBN微乳、微乳凝胶的制备。以茶树油作为微乳油相,通过考察制剂中小檗碱在表面活性剂与助表面活性剂中溶解度、绘制伪三元相图及测定电导率确定微乳处方及构型,并考察其理化性质,测定小檗碱含量;同时探讨微乳制备工艺对KBN复方有效部位及药效成分的适用性。在此基础上,优选凝胶基质卡波姆-940及羟乙基纤维素的用量,制备KBN微乳凝胶。
  2.KBN微乳、微乳凝胶的透皮吸收行为及体外抑菌药效研究。以小檗碱的透皮速率、单位面积累积渗透量等透皮吸收行为指标,采用改良Frans体外扩散池,进行小鼠离体皮肤体外渗透实验,评价KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶的体外透皮吸收效果;并采用打孔法比较KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶、药液对白色念珠菌的抑菌药效。
  3.KBN微乳、微乳凝胶治疗小鼠VVC模型药效研究。以白色念珠菌为致病菌建立小鼠VVC模型,通过检测小鼠阴道内菌落数变化,并辅以对阴道组织病理分析,确定给药周期,考察KBN微乳、微乳凝胶对小鼠VVC模型的药效,评价KBN各制剂间药效差异。
  结果:
  1.KBN微乳、微乳凝胶的制备。筛选所得微乳表面活性剂为曲拉通,助表面活性剂为1,2-丙二醇,表面活性剂与助表面活性剂比例为2∶1。优化KBN微乳制剂处方为:KBN浓缩药液(0.629生药/mL)646.9g、茶树油29.7g、曲拉通215.6g、1,2-丙二醇107.8g。制得微乳平均粒径为12.71nm,多分散指数为0.12,为水包油(O/W)型微乳;载药量为0.40g/mL,盐酸小檗碱含量为3.38mg/mL。所得微乳处方亦适用于大孔树脂精制后KBN有效部位及药效成分小檗碱。
  优化KBN微乳凝胶处方为:卡波姆-94013g,丙三醇52g,KBN微乳375g(1.6g生药/mL),三乙醇胺25g,羟乙基纤维素10g,制备工艺为:卡波姆-940于蒸馏水中溶胀制得2.5%卡波姆空白凝胶,将KBN微乳缓慢加入空白凝胶中,搅拌均匀,再加入羟乙基纤维素搅拌(1200r/min,40℃)至分散均匀,滴加90%三乙醇胺调pH至6.0~7.0,蒸馏水补重至1000g,即得。
  2.KBN微乳、微乳凝胶的透皮吸收行为及体外抑菌药效研究。对同等生药浓度下KBN微乳(0.2g生药/mL)、微乳凝胶(0.2g生药/g)、触变凝胶(0.2g生药/g)透皮吸收行为及体外抑菌药效研究结果显示,KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶中小檗碱在8h内透皮速率分别为78.63J/μg·cm-2·h-1、25.09J/μg·cm-2·h-1、26.19J/μg·cm-2·h-1,单位面积累积渗透量分别为612.49±90.02μg·cm-2、196.25±25.65μg·cm-2、224.05±16.09μg·cm-2,透皮吸收百分率分别为38.40±5.66%、24.18±4.16%、16.21±1.47%。提示KBN微乳透皮效果优于KBN微乳凝胶及触变凝胶。
  在体外抗白色念珠菌药效上,经打孔法实验,KBN药液、微乳、微乳凝胶、触变凝胶对白色念珠菌抑菌圈分别为:12.26±1.57mm、12.44±0.69mm、13.29±0.84mm、11.73±0.89mm。结果表明KBN各制剂均显示较佳的抑菌作用,然三种制剂与KBN药液间未见明显差异。
  3.KBN微乳、微乳凝胶治疗小鼠VVC模型药效研究。考察同等生药浓度下KBN微乳(0.2g生药/mL)、微乳凝胶(0.2g生药/g)、触变凝胶(0.2g生药/g)治疗小鼠VVC模型药效。给药1周治疗后,KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶组小鼠阴道内菌落数分别为51.25±24.71,61.92±33.60,57.83±33.98;病理切片结果显示尚存炎症,且可见白色念珠菌菌丝。经给药3周治疗,KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶组小鼠阴道内菌落数分别为7.50±4.81,5.67±4.08,3.67±2.16,菌落数几近消失,病理切片结果显示炎症明显改善,且无白色念珠菌菌丝存在。因此确定给药周期为3周,且分别于给药后第3、7、14、21天进行菌落数检测。
  在此基础上,开展KBN各制剂治疗小鼠VVC模型药效研究。结果表明,经3周给药治疗后,KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶、香莲外洗液、洁尔阴、克霉唑组小鼠阴道内菌落数分别为6.50±4.43、5.60±4.27、6.20±4.37、7.30±4.16、11.10±4.72,3.00±2.40。给药3天后,与模型组相比,KBN各制剂组菌落数均显著降低(P<0.05),且给药3、7、14天后,KBN各制剂组显示出优于洁尔阴的药效(P<0.05);小鼠阴道组织经HE、PAS染色后分析,相比于模型组,各给药组小鼠固有层水肿及炎性细胞浸润现象得到改善,炎症减轻;且无白色念珠菌菌丝存在。
  结论:
  1.本实验制得KBN微乳及微乳凝胶最大载药量分别为0.40g/mL、0.60g/g,显著高于课题组前期制得载药量为0.20g/g的KBN触变凝胶,有助于解决中药洗剂制剂载药量低及药效成分小檗碱含量少的问题,可为以黄连、黄柏等为主药治疗VVC的洗剂工艺优化提供借鉴;
  2.KBN微乳中小檗碱8h内透皮速率及累计透过总量明显高于KBN微乳凝胶及触变凝胶,体现出微乳这一新型给药载体透皮吸收快的剂型优势;
  3.KBN微乳、微乳凝胶给药3周对VVC模型小鼠有良好的抑菌、改善局部炎症药效。
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