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第一部分TNFα协同CD8+T细胞诱导受体HUVEC细胞凋亡的实验研究目的异基因造血干细胞移植时,循环血中损伤脱落的内皮细胞的数量明显增加,且与移植相关的血管并发症成正相关。移植的动物模型中,内皮细胞凋亡是发生于其它组织器官损伤之前的早期事件,而其发生的机制及诱导因素尚不明确,我们的研究目的是以细胞因子TNFα为诱导因素,观察异基因CD8+T细胞导致血管内皮细胞凋亡的体外效应。方法采用密度梯度法分离人周围血单个核细胞,用CD8+T细胞亚群阴性分选柱试剂盒分选出CD8+T细胞。将HUVEC细胞株分为4组,分别是1)1640对照组2)低剂量TNFα处理组3)无TNFα处理混合淋巴细胞培养组4)低剂量TNFα处理混合淋巴细胞培养组。用AnnexinV和PI双标后,荧光免疫显微镜及流式细胞仪进行凋亡分析结果低剂量5ng/mlTNFα不能引起HUVEC凋亡,与1640对照组比较无显著性差异p>0.05。用同样剂量的TNFα预处理HUVEC后,与CD8+T细胞进行混合培养,流式细胞仪检测显示其24小时时间点的早期凋亡率高达83.6±0.42%,是非TNFα预混合培养组的5.8倍。组间比较存在非常显著的统计学差异p<0.001。结论体外供体CD8+T淋巴细胞能够引起受体血管内皮细胞凋亡。低剂量的TNFα的协同对凋亡起明显的放大作用。第二部分A20和Caspase3在异基因CD8+T细胞致HUVEC凋亡途径中的表达及意义目的异基因造血干细胞移植时,血管内皮细胞凋亡不仅是移植相关血栓并发症的重要病理特征,而且可能在移植物抗宿主病的组织器官损伤中起早期介导作用。通过检测血管内皮细胞凋亡信号途径中A20蛋白及Caspase3的表达以明确凋亡发生的机制方法采用密度梯度法分离人周围血单个核细胞,用CD8+T细胞亚群阴性分选柱试剂盒分选出CD8+T细胞。HUVEC细胞株经过低剂量TNFα处理后与CD8+T细胞进行混合培养。用Annexin-V和PI双标后,流式细胞仪对HUVEC进行凋亡分析,用全波长荧光分光光度计测定凋亡相关蛋白Caspase3的活性。用westen-blot方法检测HUVEC中A20蛋白的表达。结果异基因CD8+T在与HUVEC混合后可引起HUVEC凋亡,流式细胞仪检测显示其24小时时间点的早期凋亡率最高,达83.6±0.42%。而晚期凋亡相关蛋白Caspase3活性在48小时时间点达高峰,荧光强度为13.59±0.27,此后显著性降低,与对照组比较存在非常显著的统计学差异p<0.001。A20蛋白在异基因CD8+T细胞导致的HUVEC凋亡中,与其严重程度成负相关。结论体外供体CD8+T淋巴细胞导致受体血管内皮细胞凋亡途径中Caspase3的激活介导了HUVEC凋亡的发生。信号蛋白A20可能对凋亡的发生起负调节作用。第三部分组织因子胞内段小干扰RNA载体的构建及其对HUVEC凋亡的保护作用目的构建组织因子胞内段小干扰RNA载体,将其转入HUVEC细胞株后,观察混合淋巴细胞反应中,在基本不影响凝血功能的情况下,对HUVEC凋亡的保护作用。方法体外设计特异性干扰组织因子胞内段氨基酸序列合成的小干扰片断,将其插入质粒DNA后转入大肠杆菌中大量扩增,抽提质粒后,用脂质体将其转入HUVEC细胞株中,磁珠法检测混合淋巴细胞反应中,培养上清液的APTT时间,流式细胞仪分析转染空载对照组、siRNAI、siRNAII凋亡细胞百分率。结果与空载对照组比较,转染了siRNAI质粒的HUVEC的凋亡率显著下降。转染了siRNAII质粒的HUVEC的凋亡率虽然不如siRNAI下降明显,但与空载对照组比较,也有显著性差异,P<0.05。测定的培养上清中APTT时间,与空白对照组比较差异无显著性,P>0.05。结论成功构建的组织因子胞内段小干扰RNA质粒,在不影响凝血功能的情况下,可对内皮细胞的凋亡起保护作用。第四部分CD4+T诱导受体HUVEC组织因子表达的信号转导机制目的阻断组织因子细胞内段的蛋白的合成,在基本不影响凝血的情况下,可以对异基因T细胞所导致的内皮细胞的凋亡起保护作用。而内皮细胞的凋亡介导了早期GVHD的发生,那么下调TF胞内段的表达可能可以减轻GVHD的程度而不影响正常凝血。如果移植后发生GVHD的同时伴发血栓并发症时,下调细胞内外段的TF的表达可以起抗凝血和减轻GVHD的双重作用。而组织因子表达的细胞内信号调控机制尚不清楚,本实验通过检测异基因CD4+T诱导HUVEC组织因子表达时细胞内信号分子的表达,为临床寻找新的治疗靶点提供实验室依据。方法采用密度梯度法分离人周围血单个核细胞,用CD4+T细胞亚群阴性分选柱试剂盒分选出CD4+T细胞。HUVEC细胞株经过γ干扰素预处理后与CD4+T细胞进行混合培养。用流式细胞仪检测HUVEC组织因子的表达,real-time-PCR检测组织因子mRNA的转录状况。Westen-blot检测信号分子JNK、P38-MAPK的表达及I-κα的磷酸化状态。结果异基因CD4+T细胞诱导HUVEC组织因子表达时,TF在混合反应后12小时明显增加,24小时达到高峰,持续至48小时后逐步降低到基础水平。而组织因子的转录活性在6小时时间点达到高峰,持续至48小时后逐步降低。细胞内信号分子JNK、P38-MAPK的蛋白和I-κα的磷酸化的蛋白在1小时内均有表达,与对照组比较,均存在显著性差异P<0.05。结论在异基因CD4+T细胞导致的HUVEC组织因子表达增高中,JNK、P38-MAPK、I-κα均有可能是其细胞内信号转导途径中的调控分子。