论文部分内容阅读
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、难治性自身免疫性疾病。关节局部有滑膜异常的炎性增生、微血管的新生以及血管翳的形成,最终造成关节软骨和骨的侵蚀,关节的破坏是其主要病理特征。到目前为止,RA的确切病因和发病机制尚不清楚,研究表明与感染及遗传等多种复杂因素有关。很多研究发现不论什么原因诱发的RA,基本上都与关节滑膜微环境失衡有关。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)和血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)作为微环境的重要参与者,它们的改变与关节滑膜微环境失衡密切相关。炎症在RA的发生发展过程中起到重要作用,关节炎性微环境的持续存在可促进RA的发生发展。慢性炎症的滑膜微环境中,充斥大量的炎性细胞因子,如1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1等,它们对RA的发生发展具有重要的作用。VEE为FLS提供细胞因子、氧和营养物质,而VEC大量分泌S1P,并激活FLS中S1P下游信号通路,是影响RA的重要因素之一。有研究证实S1P与1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine-1-phosphate receptors,S1PRs)结合后,参与FLS的炎性细胞因子分泌、增殖与凋亡,进而调控RA的发生发展。基于炎性微环境中VEC和FLS的研究现状及其在RA发生发展中的潜在意义,本研究拟建立TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothelial cell,HUVEC)炎症损伤模型,检测HUVEC中S1P的含量的变化,并用HUVEC条件培养基培养类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblasts,RASFs),探究S1P是否是VEC对FLS作用的关键分子。阐明S1P参与VEC对FLS作用的可能分子机制。并进一步探讨GE干预HUVEC的可能作用靶点,调控S1P信号通路的级联反应,发挥抗炎免疫作用。为中药抗炎免疫有效成分防治RA提供新靶点及策略,也为中药有效成分的研究与应用提供更多的实验依据。1目的观察S1P在TNF-α诱导HUVEC炎症模型中的表达变化情况,HUVEC条件培养基对RASFs增殖及细胞因子分泌等功能的影响,探讨炎性细胞因子通过S1P信号转导在VEC对RASFs作用中的分子机制;观察GE给药后,是否能降低HUVEC中S1P的表达水平,抑制RASFs中S1P下游Ras-Erk1/2信号通路,阐明GE作用靶点和抗炎免疫的作用机理。2方法体外培养HUVEC,建立TNF-α诱导HUVEC炎症损伤模型。ELISA法检测HUVEC生成和分泌S1P含量的变化;为探讨S1P在HUVEC中是如何产生以及GE的作用靶点,用RT-qPCR和Western blotting法检测HUVEC中Erk1/2和鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)基因和蛋白表达水平以及蛋白磷酸化水平。为探讨S1P信号转导在VEC对RASFs作用中的分子机制,采用不同组别的HUVEC条件培养基培养RASFs,CCK-8法和ELISA法分别检测HUVEC条件培养基对RASFs的增殖活性和细胞因子分泌的影响;用RT-qPCR和Western blot法测定RASFs中Ras-Erk1/2信号通路中关键基因和关键蛋白的表达。3结果3.1 GE对TNF-α诱导HUVEC分泌S1P水平的影响不同组别细胞内和细胞外S1P含量变化趋势一致,与空白组相比,TNF-α组中S1P含量明显升高(P<0.01);GE给药组中S1P含量呈下降趋势,且100μg/mL作用最为显著。3.2 GE对TNF-α诱导HUVEC中P-SphK1胞质与胞膜表达的影响TNF-α组P-SphK1胞质和胞膜蛋白表达量相对于对照组明显升高(P<0.01),提示TNF-α诱导P-SphK1蛋白由细胞质向细胞膜转移,促进S1P的生成;与TNF-α组比较,不同浓度的GE、FTY-720(1μM)和SCH772984(1μM)处理细胞后,P-SphK1胞质和胞膜蛋白表达量均显著降低(P<0.01)。3.3 GE对TNF-α诱导HUVEC中P-Erk1/2与SphK1的共表达影响正常情况下,HUVEC中P-Erk1/2与SphK1有共表达;与空白对照组相比,TNF-α组中P-Erk1/2与SphK1的共表达显著增加(P<0.01);与TNF-α组比较,不同浓度GE组中P-Erk1/2与SphK1的共表达均降低(P<0.01),与FTY-720组、SCH772984组作用相一致。3.4 GE对TNF-α诱导HUVEC中S1P信号通路关键基因表达的影响TNF-α组HUVEC中Erk1/2mRNA和SphK1mRNA的表达相对于对照组HUVEC显著升高(P<0.01);与TNF-α组比较,经GE给药处理后,GE中、高剂量组均显著降低了Erk1/2mRNA和SphK1mRNA的表达量(P<0.01),并呈现剂量相关性。FTY-720组、SCH772984组与GE组具有相似的作用。3.5 GE对TNF-α诱导HUVEC中S1P信号通路关键蛋白分子的表达及活化的影响与空白对照组相比,TNF-α组中P-Erk1/2、P-SphK1和SphK1蛋白显著高表达(P<0.01)。与TNF-α组比较,不同浓度GE作用后,P-Erk1/2、P-SphK1和SphK1的蛋白表达量与TNF-α组相比均降低(P<0.05),与FTY-720组、SCH772984组作用相一致。3.6 HUVEC条件培养基对RASFs增殖的影响TNF-α条件培养基组中RASFs的增殖水平,与对照条件培养基组相比明显上升(P<0.01);不同浓度GE给药的条件培养基组中RASFs的增殖水平呈不同程度的下降,且50和100μg/mL GE组条件培养基下调更为显著(P<0.01);FTY-720组条件培养基和SCH772984组条件培养基亦可显著抑制RASFs的细胞增殖能力(P<0.01),具有统计学意义。3.7 HUVEC条件培养基对RASFs中IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β1分泌水平的影响与空白对照条件培养基组相比,TNF-α条件培养基组RASFs中促炎细胞因子IL-1β和IL-6的分泌水平明显升高,抗炎细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌水平显著降低(P<0.01);与TNF-α条件培养基组比较,GE条件培养基组RASFs中的IL-1β和IL-6水平显著下降(P<0.05),TGF-β1和IL-10水平明显上升(P<0.05);FTY-720条件培养基组、SCH772984条件培养基组与GE条件培养基组作用相一致。3.8 HUVEC条件培养基对RASFs中Ras-Erk1/2信号通路关键基因的影响TNF-α条件培养基组RASFs中S1PR1mRNA、RasmRNA和Erk1/2mRNA的表达相对于对照条件培养基组显著升高(P<0.01);不同浓度GE条件培养基均显著降低了S1PR1mRNA、RasmRNA和Erk1/2mRNA的表达量(P<0.01),与FTY-720条件培养基组、SCH772984条件培养基组具有相似的作用。3.9 HUVEC条件培养基对RASFs中Ras-Erk1/2信号通路关键蛋白分子的影响与空白对照条件培养基组相比,TNF-α条件培养基组RASFs中S1PR1、Ras和P-Erk1/2蛋白显著高表达(P<0.01)。不同浓度GE条件培养基组RASFs中S1PR1、Ras和P-Erk1/2的蛋白表达量,与TNF-α条件培养基组相比均降低(P<0.05);FTY-720条件培养基组、SCH772984条件培养基组与GE条件培养基组作用相一致。4结论1.炎性细胞因子TNF-α诱导HUVEC中Erk1/2发生磷酸化,活化后的Erk1/2进一步激活SphK1,从而增加S1P生成。这些作用可被加入的GE消除。2.GE抑制HUVEC中P-Erk1/2和SphK1蛋白的表达,从而减少S1P的产生,与P-Erk1/2抑制剂SCH772984和SphK1抑制剂FTY720作用相似,提示GE的作用靶点可能是P-Erk1/2和SphK1。3.GE作用血管内皮细胞的条件培养基抑制FLS增殖和调节FLS中促炎细胞因子和抑炎细胞因子的相对平衡,是与GE抑制SphK1/S1P/S1PR1及其下游Ras-Erk1/2信号通路有关。