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溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是引起海水养殖动物弧菌病的主要病原菌之一,并且对渔业中常用的抗生素有较高的耐药性。蛋白翻译后修饰（Post-translational modifications,PTMs）可通过改变关键耐药蛋白的活性调控细菌的耐药性,研究已发现溶藻弧菌的一些关键耐药蛋白具有琥珀酰化修饰（Ksuc）,提示该修饰可能参与溶藻弧菌的耐药过程。据此,本研究结合蛋白琥珀酰化修饰组学技术和分子生物学技术,研究琥珀酰化修饰对溶藻弧菌耐药的影响,旨在为琥珀酰化修饰对细菌耐药机制的阐明和新药物靶点的选择提供理论依据。分别测定氟苯尼考和恩诺沙星对溶藻弧菌野生株HY9901的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）,通过体外诱导使野生株HY9901获得耐药性。结果显示:氟苯尼考和恩诺沙星对野生株HY9901的初始MIC均为2 μg/mL;诱导后获得氟苯尼考耐药株FBNK和恩诺沙星耐药株ENSX,对应的MIC分别为64μg/mL 和 32 μg/mL。利用4D-LFQ修饰蛋白质组学技术鉴定耐药株和野生株HY9901的蛋白琥珀酰化修饰水平,对差异修饰蛋白进行生物信息学分析。结果表明:氟苯尼考耐药株FBNK中1150个蛋白修饰水平显著上调,67个蛋白显著下调;恩诺沙星耐药株ENSX中1027个蛋白修饰水平显著上调,106个蛋白显著下调;差异修饰蛋白主要富集于抗生素的生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生和TCA循环等代谢通路;基序分析发现34个赖氨酸琥珀酰化修饰保守基序,其中出现频率最高的是K（-7）Ksuc,出现频率最低的是K（-9）Ksuc。从琥珀酰化修饰差异显著的耐药蛋白中,选择磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）为研究对象,分析发现氟苯尼考耐药株FBNK的PEPCK中有18个琥珀酰化修饰位点的修饰水平显著上调,在恩诺沙星耐药株ENSX中有9个位点显著上调,1个位点显著下调。对pepck基因进行克隆和生物信息学分析、原核表达分析,并验证PEPCK的赖氨酸琥珀酰化修饰。结果发现:该基因全长为1629 bp,编码543个氨基酸,与魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）的同源性高达 99%;预测发现一个 PEPCKATP（23-493 aa）功能结构域,与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的PEPCK单亚基有相似的构型,与其互作的蛋白主要存在于丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生和TCA循环等代谢通路中;完成原核表达载体pET-28a-pepck的构建,获得纯化的PEPCK重组蛋白并制备鼠抗;Western blot结果显示,溶藻弧菌HY9901体内的PEPCK天然蛋白和体外表达的重组蛋白均具有琥珀酰化修饰。通过重叠PCR和同源重组技术构建HY9901 Δpepck突变株,对Δpepck突变株的生物学特性及转录水平进行分析。结果表明:成功构建Δpepck突变株,该突变株能够正常生长,遗传稳定性好,胞外蛋白酶活性无显著变化,但泳动能力显著降低;生物被膜形成能力在培养6 h和12 h时显著低于野生株;药敏试验结果显示Δpepck突变株对部分β-内酰胺类、青霉素类、多肽类以及氨基糖苷类抗生素耐药性增强,而对头孢菌素和大环内酯类的敏感性增强;转录组学分析发现Δpepck突变株中,1025个基因表达显著上调,443个基因表达显著下调,差异基因主要与催化活性、结合、转运活性和核酸结合转录因子活性相关,参与了细胞过程、单组织过程和代谢过程等生物学进程,涉及的代谢通路主要是双组分系统、群体感应、生物膜形成、细菌趋化性、脂肪酸代谢和脂肪酸降解等相关代谢途径。qPCR验证的emrD、thiG、thiH、aceB、kdpD、mmsB基因转录水平与RNA-Seq的表达量趋势相同,表明转录组学结果可靠。利用快速定点突变技术,将耐药株中获得的PEPCK琥珀酰化修饰差异位点的赖氨酸（K）分别突变成谷氨酸（E,模拟琥珀酰化修饰）和精氨酸（R,模拟去琥珀酰化修饰）。采用SWISS-MODEL预测位点突变对PEPCK蛋白结构的影响,测定突变株的PEPCK酶活性以及在不同浓度的氟苯尼考或恩诺沙星条件下的耐受能力。结果表明:成功构建PEPCK蛋白15个琥珀酰化修饰位点的30株点突变株;SWISS-MODEL预测显示不同修饰位点的突变可引起PEPCK蛋白空间结构产生不同程度的变化;K117E、K263E、K347E等5株突变株的PEPCK酶活性显著升高,K263R、K289R、K329R等9株突变株的PEPCK酶活性显著降低;K76E、K117E、K263E等13株突变株的细菌存活能力显著升高,K347R、K374R、K391R等6株突变株的细菌存活能力显著降低;对于相同位点的2种突变株,将K突变成E的酶活性均高于突变成R的。综上所述,溶藻弧菌PEPCK的琥珀酰化修饰能影响其对氟苯尼考和恩诺沙星的耐药性。本研究结果加深了对细菌耐药性产生的认识,为弧菌病的防治及新型抗菌药的研发提供了理论依据。