研究背景:腰椎间盘退变是一种常见的腰椎疾病,可随年龄的增长而逐步加重,既往研究认为腰椎间盘退变是一种由多因素共同作用导致的临床疾病。目前有研究提示,腰椎间盘退变相关基因的遗传多态性位点广泛参与椎间盘退变的发病过程。随着人类基因组计划(human genome project,HGP)、人类基因组单体型计划(HapMap)的完成和高通量基因测序技术的高速发展。全基因组关联研究方法被广泛运用到复杂疾病的遗传学研究中。通过高通量基因分型测序,全世界多个国家的科研团队通过合作,完成了 HGP和HapMap数据库计划。利用现有的SNP数据库以及全基因组关联分析(GWAS)的应用,与腰椎间盘退变的许多相关基因和易感致病位点被筛选出来。其基因种类大致可分为四类:1、与腰椎间盘结构相关的基因;2、与腰椎间盘代谢功能相关的基因;3、与腰椎间盘炎症、凋亡相关的基因;4、与腰椎间盘疼痛发生的相关基因。这些基因和致病位点的筛查,有利于提高未来对该疾病分子诊断的准确率,同时也为未来能够在分子水平的治疗奠定了基础。目前有研究认为,腰椎间盘的退变与代谢相关,包括腰椎间盘髓核细胞的能量代谢、瘦素调控等环节。FTO基因是肥胖、Ⅱ型糖尿、癌症等领域的热门研究基因,它广泛参与机体各组织的能量代谢活动,并且FTO基因还与瘦素代谢密切相关。FTO基因可能通过瘦素的调节干扰腰椎间盘的正常代谢,从而促进腰椎间盘组织的退变。既往有两项研究曾报道FTO基因与腰椎间盘退变的关联性,然而由于其研究样本量的局限,导致最终验证效能偏低。在本次研究中,为提高基因关联分析研究的可靠性,我们共纳入了 999中国汉族人群,这是迄今为止研究FTO基因与腰椎间盘退变发病风险的最大人群队列,以此能在更大样本的基础上去探索FTO基因多态性改变与腰椎间盘退变的关联性。研究目的:本课题利用大样本队列,研究FTO基因19个多态性位点改变与中国汉族人群腰椎间盘退变发病风险的关联分析,拟为临床分子诊断提供可参考的基因候选位点。研究方法:本章节课题采用人群队列病例-对照的研究方法,1、研究对象:病例组来自于2012年10月～2017年9月期间就诊于北京协和医院骨科的腰腿痛患者。对照组来自于同期间北京协和医院健康体检中心进行体检、自愿参与本项目的正常人群。按照严格的入组流程,对符合研究要求的病例和对照人群进行分组。2、根据国际人类基因组单体型图计划(http://www.hapmap.org)和NCBISNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)提供的基因候选位点数据,应用Haploview软件优先选取FTO基因内最小等位基因频率在5%以上的SNPs位点,共选取19个位点。3、提取全血DNA,应用Sequenom MassARRAY SNP平台进行多态性位点的检测;4、基于病例组和对照组的Hardy-Weinberg(HW)平衡检验和连锁不平衡(LD)分析。5、关联研究数据分析,包括:等位基因和基因型相关性分析、单体型相关性分析、SNP-SNP相互作用分析。研究结果:1、经严格的入组流程,最终病例组纳入502人,对照组纳入497人,经术前MRI资料统计,病例组502人均患有不同程度的腰椎间盘退变症状,所有患者合计腰椎间盘退变节段有2309个;2、病例组和对照组的Hardy-Weinberg(HW)平衡检验结果显示17个SNPs符合HW平衡检验;3、在符合Hardy-Weinberg平衡的17个SNP中,rs1121980多态性位点C.→T改变,在95%可信区间内(1.024-1.666),其P值小于0.05(0.0309),其比值比(OR)为1.306,大于等位基因比值比1,因此,T等位基因是rsl121980位点的风险等位基因;4、基因型关联分析提示,rs2689247的AG基因型和rs16952955的AC基因型是腰椎间盘退变发病的相对低风险因素;5、单体型分析提示17个FTO多态性位点中存在两个连锁单体型区块;6、SNP与SNP相互作用关系分析中,存在5个多态性连锁位点与腰椎间盘退变相关。结论:1、在中国汉族人群中,FTO基因遗传多态性变异与腰椎间盘退变患病风险相关。rs1121980的T等位基因是腰椎间盘退变的风险等位基因,可成为腰椎间盘退变疾病筛查和预后的生物标志物;2、携带有rs2689247的AG基因型和rs16952955的AC基因型的患者,较对照组具有相对较低的发病风险,提示这两种基因型组合可作为疾病的观察指标;3、本课题还在队列关联分析中发现两个单体型和五个SNP-SNP组合与腰椎间盘退变相关,可作为遗传筛查和功能实验的候选多态性位点,它们潜在的生物学功能,有待进一步深入研究。研究背景:先天性脊柱侧凸(Congenital Scoliosis)是一种在胚胎发育期椎体发育异常导致脊柱侧方弯曲≥10°的先天性骨骼畸形疾病。先天性脊柱侧凸具有进展快、畸形重、并发症多等特点,严重时可致患者瘫痪,是造成青少年残疾的主要疾病之一,给家庭和社会带来极大的负担。先天性脊柱侧凸临床分为三型:Ⅰ型是一个或多个椎体的部分或完全形成障碍,Ⅱ型是两个或多个椎体部分或完全分节不良,Ⅲ型是同时存在这两种畸形。先天性脊柱侧凸的脊柱畸形可以单独存在,也可与其他系统发育畸形,如心脏、肾脏、生殖系统等畸形共同存在。先天性脊柱侧凸是由胚胎发育时期,体节发育受干扰引起的先天性疾病。胚胎体节发育的过程是受多个信号通路和基因的共同参与和调节。其中重要的包括NOTCH、WNT/H-catenin、成纤维细胞生长因子通路(FGF)、TGF-β信号通路等。在胚胎体节发育期,TGF-β及其下游多个分支信号网络(如BMP,Nodal,GDF家族等)发挥着重要作用。GDF3是TGF-β超分子家族的配体,也属于TGF-β下游Nodal信号通路的重要组成部分,GDF3也是BMP信号通路的抑制因子,能够抑制软骨增殖分化、进而影响成骨过程,造成骨发育不良的表型。目前已报道的GDF3基因突变与脊柱侧凸、Klippel-Feil综合征、小眼畸形相关。携带有GDF3基因突变的患者具有脊柱畸形的表型:如Klippel-Feil综合征、胸腰椎的脊柱侧凸、肋骨的缺失等。因此,GDF3基因可作为先天性脊柱侧凸发病的重要候选基因。目前对先天性遗传疾病的筛查,临床检测手段有基因组DNA测序、转录组测序以及蛋白质组、代谢组等方面的研究,通过对患者的血样本DNA、RNA及蛋白成分和其他样本的综合分析,能从根源上研究某一类遗传疾病的发病机理。从研究基因组突变位点角度,目前主要采取全外显子测序,或者更高数据量的全基因组测序。从临床筛查致病位点的角度,全外显子测序具有成本低、数据量相对小,易于从基因表达的角度挖掘某些致病位点。致病位点是基因能否产生致病性的重要因素,基因不同致病位点,可能会导致不同的疾病表型及基因的功能改变,因此,对于致病位点的研究和评估,在研究某个基因行使遗传功能时,尤为重要。目前来说,基因致病位点可大致分为:错义突变、无义突变、缺失突变、插入突变、移码突变、染色体拷贝数变异等。对于这些突变位点的综合评估,包括遗传学、分子生物学水平的验证,可为进一步研究基因功能提供有力的理论依据。研究目的:本课题基于先天性脊柱侧凸患者的全外显子组测序,筛选GDF3基因相应的突变位点。通过对GDF3基因致病位点的生物信息学解读和下游分子生物学实验,可为今后GDF3基因遗传致病性的临床遗传筛查和咨询,提供分子生物层面的致病证据。研究方法:1、本章节课题根据纳入和排除标准,共纳入13名散发的中国汉族人群先天性脊柱侧凸患者;2、提取全血DNA,对患者队列进行全外显子组测序;3、对全外显子组测序结果进行Sanger测序再验证;4、从患者队列中筛选GDF3基因错义突变位点,使用DNAMAN6.0软件与NCBI GeneBank数据库中下载的核苷酸参考序列和氨基酸序列进行多序列比对;与HGMD、Clinvar数据库中已存突变、NCBI dpSNP数据库中的多态性位点以及NCBI Pubmed上收录文献所报道的变异位点进行核对分析;5、GDF3基因变异位点致病性和保守性评估:使用SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster对候选位点进行评估;采用ClustalW多重序列比对软件,对人类GDF3和其他八种脊椎动物进行突变氨基酸同源序列比较;6、GDF3基因变异位点结构分析:使用Swiss-model server进行GDF3蛋白质的三维建模;DUET软件分析局部构象改变和能量变化;使用UCSF Chimera在蛋白质氢键形成构象上去解析突变位点改变对三维结构的影响,以及Ligplot软件对与蛋白相互作用的分子氢键、疏水键等进行进一步预测;7、构建GDF3野生型和突变体的质粒,构建SOX9报告基因质粒,,做双荧光素酶报告基因实验,论证突变位点对GDF3转录活性的影响;8、转染GDF3野生型和突变体质粒,论证突变位点对GDF3蛋白功能的影响。研究结果:1、经全外显子组测序,发现13名先天性脊柱侧凸患者分别携带有五种GDF3基因变异;2、Sanger测序验证13个CS患者的GDF3基因所携带的突变位点与全外显子测序结果一致;3、经数据库比对,初步判定c.250C>T和c.251G>T为新突变预测为致病性,c.644 A>G为新突变致病性未知,而c.635 C>T和c.751 G>A为报道与临床表型相关但致病性未知的变异位点;4、采用ClustalW软件对5个GDF3基因突变位点进行多重同源序列比对。经计算,R84位点是为高度保守的氨基酸位点;其余位点在至少5个物种中较为保守;5、双荧光素酶报告实验结果显示,c.251G>T、c.635 C>T、c.751G>A位点突变,能够干扰GDF3基因本身的转录激活能力,而c.250 C>T和c.644 A>G位点突变对GDF3基因的转录活性无显著影响;6、Western Blot实验结果显示,R84L、S212L、215S、A251TT能导致细胞内成熟的GDF3蛋白较正常组表达量明显降低;在上清中,S212L、N215S、A251T突变对GDF3蛋白成熟影响较大。而R84C无论在上清还是在细胞内均不影响GDF3蛋白的成熟;7、DUET软件预测R84L位点能增加肽链局部的热力学改变;UCSF Chimera软件发现N215S突变后,局部肽链的构象发生了改变;Ligplot软件发现第212位丝氨酸突变成亮氨酸后,亮氨酸除了与第210、第214位氨基酸残基形成氢键以外,还与第136位苏氨酸形成第三个疏水键。结论:1、本章节课题通过对先天性脊柱侧凸患者全外显子组测序,筛选出携带GDF3罕见变异共13名患者,共有5个罕见突变位点;2、c.635C>T,c.251 G>T,c.751G>A三个位点,经功能实验验证,其能影响下游SOX9的转录激活活性及GDF3蛋白本身的剪切成熟,在分子水平上可认为具有致病性;3、c.644A>G仅影响GDF3蛋白的成熟,对转录调控无明显影响。而c.250 C>T位点对GDF3的生物学功能无明显影响。