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多粘菌素作为抗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线,现在已经被广泛应用于革兰氏阴性菌的治疗。近年来,越来越多的研究表明,阳离子抗菌肽多粘菌素同样可以作用于革兰氏阳性菌。而随着多粘菌素的应用,革兰氏阳性菌中已经发现了应对这种阳离子抗菌肽的抗性机制。dlt操纵子可通过对革兰氏阳性菌细胞壁的丙酰化,对细胞表面的正电荷进行修饰,从而增加对多粘菌素E的抗性。本文着眼于多粘菌素E和枯草芽孢杆菌的相互作用,对dlt操纵子在多粘菌素E的抗性机制中的作用展开研究。本文选取枯草芽孢杆菌WB800来源的dlt操纵子基因和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pWBUC01,设计XhoⅠ和MluⅠ为双酶切位点,经酶切连接在大肠杆菌BW25113中构建dlt操纵子重组质粒pWOP。随后,通过Spizizen化学转化法,将重组质粒pWOP转入枯草芽孢杆菌SCK6中,成功获得dlt操纵子过表达的枯草芽孢杆菌SCK6-2。通过比较多粘菌素E对枯草芽孢杆菌SCK6/pWBUC01（枯草芽孢杆菌SCK6-1）和枯草芽孢杆菌SCK6-2的MIC值,发现SCK6-2比SCK6-1菌株更耐受多粘菌素E,说明dlt操纵子过表达有助于提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E的耐受性。通过比较SCK6-1和SCK6-2菌株在多粘菌素E处理下的生长曲线及CFU,发现dlt操纵子过表达能提高多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌的存活率。为了进一步研究dlt操纵子过表达提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E耐受性的原因,我们比较了多粘菌素E处理下菌株培养上清液的OD260nm和OD280nm下吸光度及NPN荧光值变化,发现dlt操纵子可减弱多粘菌素E对枯草芽孢杆菌通透性的影响。随后,使用阳离子蛋白质细胞色素c表征dlt操纵子过表达后细胞表面净负电荷的变化,发现dlt操纵子的过表达会降低枯草芽孢杆菌与细胞色素c的结合,表明dlt操纵子的过表达可增加枯草芽孢杆菌表面的正电荷,降低净负电荷量,从而减弱带正电荷的多粘菌素E对细胞的静电结合作用。由于多粘菌素E生产菌多粘类芽孢杆菌不含dlt操纵子,dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中表达有望提高其抗性,从而提高多粘菌素E的产量。为此,本实验考察了枯草芽孢杆菌源dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中的表达及其影响。首先优化了多粘类芽孢杆菌ATCC842和多粘类芽孢杆菌C12的电转化条件,建立了最优的电转化体系。接着,构建了含dltA基因的重组质粒pWDA。然后,在电转化最优体系下,将pWDA和pWOP分别电转化多粘类芽孢杆菌ATCC842,发现pWDA能被成功转化,但效率比较低;而pWOP不能被成功转化至菌株ATCC842。可能的原因是多粘类芽孢杆菌电转化效率本身比较低。另外,dlt操纵子比dltA大的多,这进一步增加了pWOP电转化难度。后续实验中,需要进一步提高电转化效率,另外也可以建立更有效的多粘类芽孢杆菌转化方法。由此,进一步研究dlt操纵子表达为提高多粘类芽孢杆菌对多粘菌素E抗性的可能性及其机制,为今后增加多粘菌素E的发酵产量提供新的思路。