卵巢上皮性癌是世界上最常见的妇科恶性肿瘤之一，其病程发展迅速，每年导致140，000病例死亡。由于早期无明显症状，且缺乏有效的早期诊断方法，70％患者就诊时已属晚期，死亡率占所有妇科恶性肿瘤相关死亡的52％。而有关卵巢癌的发病机制目前仍尚未完全明确。大量研究表明，microRNA(miRNA)与多种疾病的发生、发展密切相关。许多miRNA一直被认为是细胞生长与分化的关键调节因子，近几年研究发现miRNA也参与肿瘤的发生、发展，发挥类似于抑癌基因或癌基因的作用，参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及转移过程。有报道指出一些miRNA异常调节肿瘤中增殖，其中包括卵巢癌。而与肿瘤相关的miRNA可通过调节恶性肿瘤细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰从而改变表观遗传的表型。目前，大量研究显示在恶性肿瘤和异常增生的细胞中，Hox基因异常表达，这表明改变Hox基因的表达对于致癌基因或肿瘤的抑制都很重要。许多Hox基因被认为能够在某些癌症中影响癌基因启动子通路和肿瘤代谢，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。Hox基因如HoxA9、HoxA10、HoxA根据肿瘤分化方式在不同的上皮性卵巢癌亚型中都有表达，这表明Hox基因在决定卵巢癌组型中起重要作用。但是miRNA在HoxB3中的作用尚不清楚。另一方面，有研究显示RASSF1A和CLDN6作为重要的抑癌基因，与HoxB3及表观遗传密切相关。国内外学者检测到卵巢癌、宫颈癌组织中RASSF1A和CLDN6基因异常甲基化。然而，有关miRNA在卵巢癌当中的作用研究报道并不多，且未有文献报道miRNA与HoxB3在卵巢癌中的关系。本研究首先通过miRNA芯片技术，筛选出在卵巢癌组织中下调表达的miR-7和miR-218，发现miR-7和miR-218与HoxB3的表达密切相关，且它们的表达水平呈负相关，miR-7和miR-218可以直接调控HoxB3的表达。而过表达miR-7和miR-218的卵巢癌细胞，通过表观遗传DNA甲基化改变和组蛋白修饰的方式，重激活肿瘤抑制因子RASSF1A和Claudin-6，以增强对卵巢癌细胞细胞周期的阻滞和克隆形成的抑制作用。该研究为人卵巢上皮性恶性肿瘤中HoxB3基因过表达和miRNAs之间的关系提供了一条新的思路，从miRNAs角度探讨了卵巢癌的发病机制，即miRNAs可能通过靶向调节HoxB3使肿瘤抑制基因表观遗传化改变，从而影响卵巢癌细胞增殖。　　第一章利用芯片技术进行卵巢上皮性癌组织miRNA的表达谱的研究——miR-7和miR-218表达下调　　目的:探讨miRNA在卵巢上皮性癌中的表达谱。　　方法:通过Agilent公司的miRNA芯片技术分析13例原发性卵巢上皮性癌Ⅰ期患者的卵巢癌组织及其对侧正常卵巢上皮组织miRNA表达谱差异，并通过Real-time RT-PCR验证芯片所得结果，;原13例原发性卵巢上皮性癌Ⅰ期患者的卵巢癌组织连同再取的19份卵巢上皮性癌组织（Ⅱ期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例）检测差异表达最明显的miRNA在卵巢癌癌组织不同病理分期中的的表达情况，筛选出在卵巢癌癌组织中差异表达最明显的miRNA进行下一步的功能研究。　　结果:芯片结果显示，与对侧正常卵巢上皮组织相比，卵巢癌组织3个miRNA表达上调，分别为miR-221，miR-222，miR-146b;有10个miRNA表达下调，分别为miR-21，miR-7，miR-218，let7家族(miR-let7a, let7b, let7c, let7d, let7e, let7f, let7g)，其中miR-7和miR-218下调最为明显，与qRT-PCR验证的结果相一致。miR-7和miR-218的表达随着肿瘤级别的增加而逐渐降低，差异有统计学意义。　　结论:①卵巢癌癌组织与其对侧正常卵巢上皮组织之间存在miRNA差异表达，其中miR-7和miR-218下调表达程度还与卵巢癌分期有关。②miRNA芯片技术检测结果可靠，可用于筛选组织、细胞间的miRNA表达谱。　　第二章 miR-7和miR-218对卵巢癌细胞的增殖能力和HoxB3基因的调节作用　　目的:研究卵巢上皮性癌中miR-7和miR-218对卵巢癌细胞的增殖能力和HoxB3基因的作用。　　方法:应用分子生物学方法预测miR-7和miR-218的靶基因。常规培养人卵巢癌细胞株SKOV-3、OVCAR-3和正常卵巢上皮细胞株IOSE80。定量RT-PCR检测miR-7和miR-218在卵巢细胞中的表达量。进行脂质体瞬时转染后，软琼脂糖克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖能力的改变，Western-blotting用于检测HoxB3蛋白水平的改变。　　结果:采用TargetScan和miRanda网站预测到HoxB3为miR-7和miR-218的靶基因。荧光定量PCR结果显示，miR-7和miR-218在卵巢癌细胞株中发生不同程度的下调，而HoxB3的蛋白表达则明显增强。Western Blot结果显示，转染外源性miR-7和miR-218到SKOV-3细胞后，随着增加miR-7和miR-218的表达，细胞中HoxB3蛋白表达水平明显减弱，转染miR-7和miR-218到SKOV-3细胞中，流式细胞术数据表明G1期细胞呈上升趋势，对照组48％，miR-7转染组为61.2％，miR-218转染组为64.3％，miR-7+miR-218共转染组为71.2％。S期细胞呈下降趋势，对照组为36.7％，miR-7转染组25.9％，miR-218转染组24.1％，miR-7+miR-218共转染组18.7％。然而，G2/M期细胞趋势则有所变化，对照组15.3％，miR-7转染组为12.9％，miR-218转染组为11.6％，miR-7+miR-218共转染组为10.1％。而软琼脂克隆形成实验显示miR-7和miR-218减少了卵巢癌细胞SKOV-3软琼脂上的克隆形成。　　结论:以上结果证实miR-7和miR-218可以下调HoxB3基因的表达。miR-7和miR-218可以抑制卵巢癌细胞的生长，可以将细胞周期阻止在G1/s期。这些结果说明在卵巢癌中异常表达的miR-7和miR-218通过抑制HoxB3，进而影响细胞增殖能力。综上说明miR-7和miR-218在卵巢癌的发生发展中发挥抑癌基因的作用。　　第三章 miR-7和miR-218靶向调节HoxB3的机制研究　　目的:验证miR-7和miR-218对HoxB3的靶基因机制调节。　　方法:构建含HoxB3-3UTR结合位点的荧光素酶报告载体，与miR-7和miR-218表达载体共转染，检测细胞中的荧光素酶活性。　　结果:成功构建含HoxB3-3UTR结合位点的荧光素酶报告载体，miR-7和miR-218表达载体与含HoxB3-3UTR结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性，降低荧光素活性比值，且两者有协同作用。　　结论:miR-7和miR-218与HoxB3的表达密切相关，miR-7和miR-218靶向调节HoxB3，且两者有协同作用。　　第四章 miR-7与miR-218对肿瘤抑制基因RASSF1A和Claudin-6影响的机制研究　　目的:研究miR-7和miR-218对RASSF1A和CLDN6表达影响的机制。　　方法:首先转染miR-7和miR-218到SKOV-3细胞中，研究细胞RASSF1A和CLDN6基因mRNA表达的改变;接着甲基化RASSF1A和CLDN6基因，研究DNA甲基化是否影响转染miR-7和miR-218的SKOV-3细胞的RASSF1A和CLDN6，并通过染色质免疫共沉淀，研究DNMT3b是否涉及RASSF1A和CLDN6的高甲基化以及miR-7和miR-218对RASSF1A和CLDN6的组蛋白乙酰化(H3乙酰化)的水平。　　结果:单独转染miR-7和miR-218后，编码RASSF1A和CLDN6的mRNA表达水平增加，而共转染miR-7和miR-218后，它们显著协同上调这些mRNA。DNA甲基化显著下调了转染miR-7和miR-218的SKOV-3细胞的RASSF1A和CLDN6，而染色质免疫共沉淀结果显示，转入miR-7和miR-218可以大幅下调与DNMT3b相关的RASSF1A和CLDN6，miR-7和miR-218可以显著上调RASSF1A和CLDN6的组蛋白乙酰化（H3乙酰化）的水平。　　结论:miR-7和miR-218可以增加RASSF1A和CLDN6基因的mRNA表达水平，miR-7和miR-218使RASSF1A和CLDN6发生表观遗传改变而被重新激活。