论文部分内容阅读
甲壳动物蜕皮调控研究,主要集中于甲壳动物高血糖素家族（Crustacean hyperglycemic hormones,CHHs）神经肽及蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）合成等方面,关于20E信号下游诸如皮层溶离、新表皮形成、附肢抖动、表皮着色等一系列生理过程的分子途径仍未可知。作为甲壳动物重要经济与生态物种,开展拟穴青蟹20E下游蜕皮调控机制研究具有重要理论意义与经济、生态价值。本课题以拟穴青蟹（Scylla paramamosain）为研究对象,选取在昆虫蜕皮中的重要神经肽基因蜕皮触发激素（Ecdysis triggering hormone,ETH）,针对拟穴青蟹“20E—20E受体—ETH—蜕皮”信号传导中的几个关键分子开展研究,明确了ETH在拟穴青蟹蜕皮中的关键作用,确认了蜕皮激素受体-2（Ecdysone receptor-2,Ec R-2）Ec R-2及转录激活因子-4（Activating transcription factor-4,ATF-4）为ETH转录激活因子,确认了ETH通过其受体ETHR调控青蟹蜕皮的发生。研究结果为首次在甲壳动物中系统阐述20E下游蜕皮调控关键靶基因ETH-ETHR信号传递模式,为青蟹等甲壳动物蜕皮不遂的防治及特异性杀虫剂药物的开发提供了新的思路。论文主要研究内容如下:1.ETH及其相关神经肽协同调控拟穴青蟹蜕皮的发生通过RNA干扰、荧光定量PCR、免疫组化等技术对ETH等神经肽基因功能进行研究。结果显示,ETH、羽化激素（Eclosion hormone,EH）及甲壳动物心激肽（Crustacean cardioactive peptide,CCAP）基因均在胸神经中高表达,表达水平随蜕皮呈周期性分布,RNA干扰结果显示以上基因的敲降均可显著抑制拟穴青蟹蜕皮的发生,多肽补偿实验后青蟹蜕皮不遂得到不同程度恢复。荧光定量PCR与免疫组化结果显示,ETH与EH在D期早、晚两阶段具不同的调控关系。结果表明ETH为拟穴青蟹蜕皮相关重要神经肽,与另外两种重要神经肽EH及CCAP关系密切。以上结果为进一步开展20E信号与ETH基因间关系奠定了基础。2.共激活因子ATF-4与Ec R-2激活ETH的转录进而调控蜕皮发生分子克隆与生物信息学分析显示,青蟹三种Ec R异构体主要在D铰链区与E配体结合域不一致,ATF-4具典型亮氨酸拉链结构,ETH上游启动子区（pro ETH）预测出31个潜在转录因子结合位点,潜在ATF-4结合位点位于ATG上游-470～-480bp附近,以上基因转录水平均呈周期性分布。体内注射实验结果显示,胸神经中ETH、EH、Ec R-2、Ec R-3及ATF-4的表达显著受20E浓度调控,与Ec R-2及ATF-4相比,Ec R-1对青蟹蜕皮抑制的表型特征不同,且Ec R-2及ATF-4对ETH的转录及表达水平具明显调控作用。酵母单、双杂交实验结果显示,Ec R-2与ATF-4之间及两者与pro ETH之间均存在明显互作。以上结果表明ATF-4及Ec R-2为拟穴青蟹蜕皮调控关键因子,二者通过20E浓度调控,激活ETH的转录进而调控青蟹蜕皮的发生。3.鉴定了ETH受体为Ecdysis triggering hormone receptor（ETHR）,证明其在青蟹蜕皮中发挥重要作用分子克隆及生信分析显示,从转录组中筛选得到的ETHR蛋白结构具G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor,GPCR）典型的七次跨膜结构,对其进行Rose TTAFold建模、分子盲对接预测及分子动力学模拟,显示其与ETH成熟肽的结合具良好稳定性,并预测得到结合位点,进一步通过酵母双杂交确认两者间存在强的相互作用。时空表达分布特征发现ETHR在D前期的胸神经表达量较高,表现出显著周期性表达特征。体内注射实验结果显示,胸神经中ETHR及下游CCAP的表达受20E浓度调控明显,ETH、ETHR及CCAP间亦存在显著的调控关系,对拟穴青蟹正常蜕皮及血淋巴凋亡调控十分重要。以上结果表明,ETH通过受体ETHR调控青蟹蜕皮发生,同时参与血淋巴凋亡及下游基因CCAP的转录调控。4.对D0、D2两期拟穴青蟹进行ETH基因干扰后的转录组学分析比较转录组分析显示,拟穴青蟹在蜕皮前期早阶段,RNA聚合酶复合体等生物大分子的转录水平明显高于蜕皮前期晚阶段;在早阶段时,ds ETH使碳水化合物代谢、叶酸合成及几丁质结合通路相关基因差异显著,候选参与基因有磷酸丙糖异构酶基因、亚甲基四氢叶酸还原酶基因、环化脱氨酶基因、围食膜因子基因等;在晚阶段时,ds ETH使钙离子通道抑制剂活性、脂肪消化吸收及心肌收缩等通路相关基因差异显著,候选基因有纤维囊性基因、磷脂酶基因、肌球蛋白相关基因等。以上结果表明,ETH在青蟹蜕皮前期早、晚阶段有着不同的生理调控途径。