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目的:皮肤鳞状细胞癌(cSCC)是皮肤常见的恶性肿瘤之一,侵袭性强是影响其预后的关键因素。研究发现皮肤鳞癌的发生、发展及侵袭转移与肿瘤细胞自噬有关;课题组前期在cSCC中研究证实Rab23可促进皮肤鳞癌细胞的侵袭,而且鳞癌组织自噬水平升高与鳞癌进展关系密切;然而,Rab23对鳞癌自噬水平的影响还不明确,特别是Rab23在皮肤鳞癌细胞自噬促进肿瘤侵袭的作用及分子调控机制尚不明确。因此,本课题拟明确Rab23是否影响鳞癌细胞自噬,并进一步探讨Rab23在皮肤鳞癌细胞自噬促进肿瘤侵袭中的作用及分子机制。方法:①通过GEO和TCGA数据库下载基因表达原始数据,利用生物信息学方法对头颈部鳞癌组织中Rab23与自噬及侵袭相关的分子表达水平进行分析,初步探讨Rab23与鳞癌自噬及侵袭的关系,进一步分析Rab23与自噬标记分子异常共表达对患者生存率的影响;②利用课题组已经建立的解放军总医院皮肤科病理组织标本库资源,免疫组化检测41例皮肤鳞癌组织、49例光线性角化病与30例头面部色素痣切除后边缘正常皮肤组织中Rab23的表达水平,对标本库中同期保存的上述组织自噬标记蛋白Beclin1、LC3B及p62免疫组化切片,深度分析Rab23的表达水平与自噬相关蛋白表达的相关性及与临床病理特征的关系;③利用课题组前期构建的转染表达不同Rab23水平的细胞系,激光共聚焦观察Rab23对自噬囊泡数量的影响以及是否与自噬囊泡共定位;蛋白免疫印迹检测Rab23对自噬标记蛋白Beclin1、LC3B及p62水平的影响,以及调控自噬相关信号通路AKT/mTOR、MEK/ERK1/2;④最后通过基因干扰Atg5的表达、药物抑制或激活细胞的自噬水平,观察Rab23对鳞癌自噬促进肿瘤细胞侵袭病理过程的影响。结果:①生物信息学分析结果示:在所有基因表达芯片中,与正常组织相比,在转录水平均未发现自噬标记物Beclin1、LC3B表达水平明显升高。高表达MMP1 mRNA见于上皮性癌的整个病变过程,Rab23与MMP1表达呈正相关关系(P<0.05或P<0.01);Rab23 表达与 HIF1A、MAPK8 和 ARFGAP1 呈正相关(P<0.01),但与 mTOR、BCL2L1表达呈负相关(P<0.05或P<0.01)。高表达Rab23 mRNA可促进皮肤鳞癌神经侵袭。TCGA分析结果与Rab23单一因素相比,Rab23联合自噬相关标记分子Beclin1、LC3B及p62的表达异常,患者总生存率(OS)下降(P<0.05),无病生存率(DFS)有降低趋势,尽管无统计学意义(P>0.05)②Rab23及自噬相关蛋白在皮肤鳞癌、光线性角化病中表达水平:与正常皮肤组织相比,免疫组化检测结果显示Rab23和自噬标记物Beclin1、LC3B在光线性角化病、皮肤鳞癌中表达水平逐渐升高,而p62水平逐渐降低(P<0.01);组间两两比较,从正常组织、光线性角化病到皮肤鳞癌,除LC3B在光线性角化病与正常组织之间,以及p62在皮肤鳞癌与光线性角化病之间无差别外,其余组间比较均有统计学意义(P<0.01);Rab23表达与自噬标记物Beclin1、LC3B表达呈正相关关系,与p62表达呈负相关(P<0.01);Rab23、Beclin1、LC3B及p62与肿瘤分化级别有关(P<0.05或P<0.01),其中 LC3B、Beclin1 与临床分期关系显著(P<0.05或P<0.01),而且 Beclin1与肿瘤大小有关(P<0.05);Rab23、LC3B、Beclin1及p62的蛋白表达水平与患者病程、年龄、性别,侵袭关系不明显(P>0.05)。③激光共聚焦结果显示与EGFP标记的空载体组(Vector)相比,EGFP标记Rab23野生型(Rab23WT)和Rab23持续活化型(Rab23Q68L)可以增加自噬囊泡的数量(P<0.01),并且与其共定位,而Rab23持续抑制型(Rab23S23N)和Vector组自噬囊泡数量减少,自噬活化与GTP结合形式有关;蛋白免疫印迹结果显示与Vector组相比,Rab23 WT和Rab23Q68L组可以促进皮肤鳞癌细胞Beclin1、LC3B表达水平(P<0.05或P<0.01);Rab23-WT 和 Rab23Q68L 组 p-mTOR 和 p-ERK 表达均升高(P<0.05 或P<0.01)。Rab23通过正向调控ERK和mTOR的表达,最终促进鳞癌细胞的自噬。给予自噬促进剂雷帕霉素及自噬抑制剂氯喹处理后,鳞癌细胞Beclin1、LC3B和p62的自噬水平呈升高或降低的趋势。④Rab23WT和Vector组转染Atg5siRNA后,细胞自噬水平下降,侵袭能力、迁移能力和创伤愈合能力均减弱。与转染Atg5-siRNA的Vector组相比,转染Atg5-siRNA Rab23WT组侵袭能力、迁移能力和创伤愈合能力均增强(P<0.05),接近于转染Atg5-siRNA-NC Vector 细胞组,但仍小于转染 Atg5-siRNA-NC Rab23WT 细胞组(P<0.05)。变化趋势:转染 Atg5-siRNAVector 细胞组<转染 Atg5-siRNARab23WT细胞组≈转染 Atg5-siRNA-NC Vector 细胞组<转染 Atg5-siRNA-NC Rab23WT 细胞组。给予氯喹(40uM)和雷帕霉素(50nM)处理后,细胞侵袭能力、迁移能力和创合愈合能力均降低,变化趋势与基因干扰Atg5表达相一致。结论:①Rab23可以促进基质金属蛋白酶MMP1mRNA表达,二者呈正相关关系;②皮肤鳞癌组织中Rab23及自噬相关基因HIF1A、MAPK8 mRNA表达上调,mTOR、BCL2L1表达下调,促进皮肤鳞癌神经侵袭;③Rab23和自噬标记分子Beclin1、LC3B及p62mRNA异常共表达,患者总生存率下降;④皮肤鳞癌组织中Rab23高表达,且与鳞癌自噬水平、分化程度及临床分期相关;⑤Rab23可以促进皮肤鳞癌细胞自噬:Rab23与自噬囊泡共定位,并可增加其数量,还可以促进自噬标记蛋白Beclin1、LC3B的表达。其机制与正向调控ERK和mTOR信号通路有关。⑥抑制鳞癌细胞自噬Atg5的表达,细胞侵袭能力、迁移能力及创伤愈合能力明显下降;Rab23上调皮肤鳞癌细胞自噬水平,促进皮肤鳞癌细胞的侵袭和迁移。