基于染料电聚合修饰的青霉素酶生物传感器的研究

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21世纪是一个经济快速增长,人民生活水平快速提高的年代。在这人民生活水平的不断提高的时候,人们的日常饮食也发生了很大的改变;肉、蛋、奶等这些动物源性食品在人们的食物结构中占据了越来越大的比例。这一变化,促进了畜牧业的迅速的发展,使得现代化的大规模的禽畜养殖场大批量建成。而青霉素是兽药中最常使用的抗生素之一,随着人们对绿色食品的意识越来越强烈,需求越来越迫切,检测其残留的意义的非常非常重大。目前用于检测青霉素的方法主要有微生物法、理化检测法(高效液相色谱、气相色谱等)和免疫分析法。微生物法是用于青霉素的检测的传统方法,跟其他微生物法的应用特点一样,在检测青霉素时该方法也具有实验过程简便,需要的样品量较少,实验结果的处理简单等优点;但这种方法的缺点也很多,在其检测过程中,非常容易受到其他抑菌因子的干扰,特异性和灵敏度都比较低,并且整个实验过程所消耗的时间很长,很难进行定量分析等。理化分析法是继微生物法之后,近十几年快速发展起来的一种检测方法,这种方法因其具有准确度、灵敏度和精确性都比较高,可用于定量分析,并且检测限低,实验结果准确可靠等优点,而受到了众多研究学者的追捧,但理化分析法所用的仪器设备非常昂贵,该方法对实验人员的专业知识和操作技能要求都很高,其操作流程复杂繁琐,所以不管是人力还是物力的成本都非常高,它不适合进行普及和推广。免疫分析法具有非常高的灵敏度和特异性,但是这种方法的成本相当高,仅一支抗体就要数千人民币,并且其研发过程长,需要投入大量的资金和时间,检测之前样品还要经历繁琐的预处理过程、实验结果也难以定量。鉴于目前方法的这些缺点,我们迫切需要建立起一种方便、准确性和灵敏度高、廉价并可用于现场分析的检测方法。传感器是一种价廉、使用方便,准确性高和结果可靠的分析工具,染料修饰的传感器能够使得传感器的性能变的更好,电化学活性变得更高。本文采用硫堇和溴酚蓝等染料作为修饰剂,运用电化学聚合法将它们对玻碳电极表面进行修饰,并配合青霉素酶组合不同的膜次序,分别制备了聚溴酚蓝青霉素酶传感器和电聚合硫堇修饰青霉素酶传感器,可直接用于青霉素G钠的检测分析。本论文的基本内容如下:1.运用循环伏安法研究了硫堇和溴酚蓝等染料的电聚合可行性,分别成功的制备了两种染料电聚合修饰的电极。通过对其电化学活性进行研究,证明经修饰后的玻碳电极比裸玻碳电极的电化学活性高出很多。2.用溴酚蓝电聚合形成聚合膜将青霉素酶包埋固定于玻碳电极上的方法成功制备了聚溴酚蓝青霉素酶电极,用于检测青霉素的残留。实验表明,传感器的溴酚蓝电聚合圈数最佳为19圈,检测时的最佳pH值为6.1,温度为24.6℃。在该条件下,传感器表现出了良好的检测性能,抗干扰性强,重现性和稳定性都很好。传感器在青霉素G钠浓度为0.1-2.6μg/mL范围内的溶液中检测呈现良好的线性,检出限为0.2μg/L,y=3.1959x+16.22(x:青霉素G钠浓度,μg/mL),回归系数为0.9985,回收率在94.4%-103%之间。3.用电化学聚合法在玻碳电极表面形成硫堇聚合膜,然后通过交联法,将青霉素酶固定于聚合膜表面,成功制备了电聚合硫堇修饰的青霉素酶传感器。实验结果表明,该传感器上酶固定化最佳条件为:戊二醛浓度为2.5%,牛血清蛋白浓度为6.6%,固定化时间为2.4h;达到最佳性能时条件为:pH为6.7,温度为26.8℃,用酶量为50.5μL该传感器在青霉素G钠(浓度为0-10μg/mL)的PBS缓冲液中进行循环伏安扫描测定,在浓度为0.08-1.0μg/mL时浓度与峰电流之间呈现出良好的线性关系,检出限为0.05μg/L,回归方程为y=18.218x+23.067(x:青霉素G钠浓度,[μg/mL),回归系数为0.9973。
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