固定肽核酸探针技术在转基因检测中的应用

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世界范围内已经纷纷制定立法对转基因植物,食品和原料进行管理,建立可靠和灵敏的转基因检测技术及方法十分必要。肽核酸(PeptideNucleicAcids,PNA)是一种DNA的类似物,以N-(2-氨基乙基)甘氨酸为结构单元取代了DNA磷酸戊糖骨架。自PNA被发现以来已被广泛地应用于分子生物学研究及相关领域,被认为是非常有应用前景的探针工具,具有许多DNA探针所不具备的优点,例如PNA骨架不带电荷,与DNA形成的复合体具有更高的热稳定性;具有更高的选择性和亲和性;杂交不受盐离子浓度的影响等。超顺磁性微球是一种新型磁性材料,具有超顺磁性,可以通过外加磁场对微球进行控制,同时其表面可以修饰多种活性基团,可与DNA、PNA进行共价结合。在生物技术、生物化学和医学等领域已经得到比较广泛的应用。本研究进行了PNA两种固定方式用于转基因水稻检测的研究,研究内容和结果如下:1.管壁固定PNA探针用于转基因检测的研究:以转Bt基因抗虫水稻TT51-1为对象,设计合成了基因特异性及品系特异性PNA探针。将地高辛修饰的PNA探针固定在地高辛抗体包被的聚碳酸酯材料的PCR管的管壁上,水稻基因组DNA变性后,与PNA杂交,通过洗脱以捕获到的目标DNA作为模板,进行PCR检测。实验通过对不同材质的PCR管、PNA浓度、杂交温度、洗脱程序等等进行了优化,得到最佳反应条件,成功地对转Bt基因抗虫水稻TT51-1品系进行了基因特异性和品系特异性检测。2.磁珠固定PNA探针用于转基因检测的研究:将氨基修饰的PNA探针与羧基修饰的磁珠进行共价结合,形成磁珠探针用于捕获目标基因片段,并通过PCR扩增进行检测。本论文对基本反应条件进行了初步探索,获得了最佳的磁珠-PNA探针的用量,成功对靶基因进行了检测。3.PNA探针对目标DNA捕获能力的研究:本研究对PNA两种固定方式的目标DNA捕获能力都进行了研究,结果显示两种固定方式都可以捕获大于15kb左右的目标片段,而检测不出位于不同染色体的内标SPS基因,则表明PNA探针具有很强的捕获能力及捕获特异性;同时进行了PNA探针对痕量目标DNA的富集研究,研究结果表明PNA探针具有对痕量目标DNA具有较好的富集能力。4.基因特异性PNA探针对于其他转基因材料的检测:利用bt基因特异性PNA探针可以用于含有bt基因的不同材料的检测,如除TT51-1外的其他转基因水稻品系KF6、KMD,转Bt基因玉米Bt11品系等。5.PNA探针用于快速检测的研究:对6种转Bt基因材料TT51-1、K6、KMD、Bt11、Mon810和Bt176的种子进行粗提取,以粗提取的DNA为模板,成功的对目标片段进行了快速检测,此过程中省去了复杂的DNA提取过程,粗提取DNA中的杂质如抑制剂、未结合的DNA等通过洗脱的过程除去,达到了DNA纯化的目的,节省了反应时间,这对于野外快速检测的实现具有重要意义。
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