蛋清源小肽的结构与协同抗氧化活性关系研究

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本研究隶属于高等学校博士学科点专项科研基金(NO.20130061110088)——“蛋清源小肽的结构与协同抗氧化活性关系研究”课题,以20种氨基酸、36条小肽和2条三肽为研究对象,综合利用体外化学实验和细胞实验对其进行抗氧化活性评价,检测氨基酸和小肽的体外抗氧化活性和细胞抗氧化活性,并研究氨基酸和小肽的协同抗氧化作用及构效关系分析。首先,在DPPH和FRAP体系中,只检测到Cys具有抗氧化活性,其余氨基酸没有呈现出DPPH和FRAP活性。Cys浓度为300μM的时候,DPPH自由基清除率达到了49.6%。而在ABTS和ORAC体系中,均有9种氨基酸呈现出了ABTS和ORAC活性,但两个体系中表现出具有抗氧化作用的氨基酸种类略有不同。在ABTS和ORAC体系中,Trp、Tyr和Cys均具有较强的抗氧化活性,His和Met只在ORAC体系中具有强抗氧化活性,而在ABTS体系中抗氧化活性较弱。在ABTS体系中,Tyr是活性最高的氨基酸,在2μM时就呈现出了19.19%的ABTS+?自由基清除能力。除此之外,氨基酸之间还表现出一定的协同作用,不同抗氧化体系的氨基酸协同结果也不相同。其次,在二肽的抗氧化能力和协同抗氧化效果研究中发现,二肽的作用结果和氨基酸作用结果具有相似性。在DPPH和FRAP体系中,只有含半胱氨酸残基的二肽具有抗氧化性,其他的二肽均没有抗氧化性,这说明半胱氨酸残基决定二肽是否有DPPH活性和FRAP活性。6条具有DPPH活性二肽的抗氧化性顺序为CK>CE>CR>CH>LC>CN,具有FRAP活性二肽的抗氧化性顺序为CR>LC>CK>CN>CH>CE,两者略有不同。在ABTS和ORAC体系中,含有抗氧化活性氨基酸的二肽,也呈现出了ABTS和ORAC活性。在ORAC体系中,YK和WR的ORAC理论值为26.7±0.2μM TE/μM,而试验中检测得到的ORAC值为31.3±1.6μM TE/μM,其抗氧化活性提高了17.2%。二肽的协同试验显示,氨基酸的协同作用结果和二肽的协同作用结果具有相似性,抗氧化体系会对二肽的协同作用产生影响,含有协同作用氨基酸的二肽之间往往具有协同效果。再次,在三肽的体外化学研究中发现,两条三肽均有DPPH、ABTS、ORAC和FRAP活性,这可能和三肽的氨基酸组成中含有Cys、Arg和His等氨酸有关。Cys决定了三肽在DPPH体系和FRAP体系中具有抗氧化能力,Cys、Arg、His决定了三肽在ABTS体系和ORAC体系中具有抗氧化能力。除此之外,CNR和CEH这两条三肽之间还呈现出了较好的协同作用,当小肽浓度为20μM时,CEH单独作用的ORAC值为19.93μM TE/μM,CNR的ORAC值为19.98μM TE/μM,实验测得的ORAC值为22.66μM TE/μM,两条三肽之间具有显著协同作用(p<0.05)。四个体外化学实验结果都表明两条三肽之间存在协同效果。最后,通过细胞实验检测了三肽在细胞内的活性作用,细胞毒性试验说明三肽对细胞不会产生毒害作用。为了进一步探究三肽对细胞的保护作用,选择400μM浓度H2O2造模,此时细胞存活率为58.9±4.7%。在MTS实验中发现,三肽能够提高细胞的存活率,呈现出对细胞的保护作用,CNR和CEH之间还具有协同保护效果,两条三肽共同作用时的细胞存活率要显著大于两条三肽单独作用时的细胞存活率数值(p<0.05)。三肽能够抑制细胞内的ROS含量,减少细胞内的ROS生成,随着三肽浓度的升高,抑制作用也越来越明显。在浓度为1μM的时候,CNR和CEH单独作用的荧光强度比CNR和CEH共同作用的荧光强度高1.12倍。同时我们发现CNR和CEH之间的协同作用会随着浓度升高而消失,说明协同作用的发生不仅和肽的种类、氨基酸结构有关,还跟肽的浓度有关。三肽对细胞内的MDA水平和抗氧化酶活性也有影响,呈现出明显的浓度依赖关系。同时加入CNR和CEH要比CNR、CEH单独作用时MDA下降更显著,蛋白酶的抗氧化活性更高,说明CNR和CEH之间存在协同抗氧化作用(p<0.05)。
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