与微生物表达系统相比,哺乳动物细胞表达系统能够更好地完成对目的蛋白的翻译后修饰(如糖基化)而倍受青睐。目前由哺乳动物细胞表达的重组蛋白类药物已经占据现代生物医药市场的最主要部分。然而哺乳动物细胞也还有一些不足之处,例如,细胞在培养过程中易遭受凋亡,对目的产物的表达还不够高效,表达的糖基结构与天然结构相比还存在某些差异,特别是位于末端的唾液酸往往缺失或错配等,这在一定程度上影响了目的蛋白的生产效率以及产品的生物学活性。因此采用基因工程和代谢工程等手段对重组细胞株进行工程化改造,弥补其不足、改进其性能,成为未来工业化发展的紧迫任务。在韩国课题组的前期研究中,发现蚕蛹血淋巴(Silkworm hemolymph, SH)能够抑制昆虫细胞和人源细胞的凋亡,且进一步研究发现其抗凋亡成分是一组结构相关、分子量约为30 kDa的蛋白(30K蛋白),包括30Kc6、30Kcl2、30Kcl9、30Kc21和30Kc23五个同源蛋白,其中30Kc6、30Kcl2和30Kc19基因被成功克隆,并在中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO) DG44中表达,以检测其抗凋亡效果。结果发现只有30Kc6基因具有显著的抗凋亡活性。但另有研究发现30Kc19基因在改善重组蛋白表达和糖基化水平方面具有重要作用。然而迄今为止,有关30Kc6和30Kc19基因的作用机制尚未明了,未来能否将它们应用于重组细胞株的工程化改造以提升其性能尚不得而知。为此,本文以表达抗CD20嵌合单克隆抗体和典型糖蛋白重组人EPO的两株重组CHO细胞为对象,前者共表达30Kc6基因,后者共表达30Kcl9基因,分别研究30Kc6基因对提高重组CHO细胞抗凋亡能力以及30Kc19基因对促进重组CHO细胞产物表达和提高产物糖基化水平的作用及其机制,并就上述基因应用于重组细胞株工程化改造的可行性作出分析和评判,旨在为未来应用于重组蛋白药物工业化生产的细胞株优化改造提供实验依据和科学指导。本文首先将30Kc6基因转染至表达抗CD20嵌合单克隆抗体的CHO细胞,分别建立三株基因稳定表达的阳性细胞克隆和三株仅仅转染空载质粒的阴性对照细胞克隆,并采用6孔培养板的贴壁培养进行实验。研究发现30Kc6基因的表达一方面显著抑制了CHO细胞的凋亡,另一方面也使抗体的比生产速率提高了1.3倍,最终获得的抗体浓度达到对照的3.4倍。进一步研究发现,30Kc6基因的表达抑制了促凋亡蛋白Bax从胞浆向线粒体的转移,并减少细胞色素C从线粒体膜间隙向胞浆的释放,抑制凋亡执行者Caspase-3的活化,从而抑制细胞凋亡的发生。同时,30Kc6基因的表达能够明显维持线粒体膜电位并促进ATP生成,提高哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性,使真核起始因子4E绑定蛋白1(4E binding protein 1,4EBP1)和核糖体蛋白S6激酶1(S6 kinase 1, S6K1)得以进一步磷酸化,促进翻译的起始和延伸,从而强化目的蛋白的表达,提高其比生产速率。另外,实验发现在转录水平上30Kc6基因表达细胞的抗体重链和轻链mRNA相对数量只比阴性对照细胞提高了8.3%和8.7%,说明30Kc6基因对目的产物表达的转录过程没有产生明显影响,其作用主要在于维持线粒体膜电位并促进ATP生成,提高mTOR的活性,从而强化目的产物表达的翻译过程。高渗透压环境下的细胞凋亡一直以来是动物细胞高密度流加培养过程开发和优化面临的难题之一,为了进一步考察共表达30Kc6基因能否抑制高渗透压诱导的细胞凋亡,本文将上述贴壁培养的阳性和阴性细胞克隆进一步适应到无血清悬浮培养,并采用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测。实验数据显示,当渗透压由正常条件的310升高到410mOsm/kg时,细胞活性均有所下降,其中渗透压提高的第2天30Kc6基因表达细胞的凋亡率上升了4.74个百分点,而阴性对照细胞凋亡率的上升则达15.45个百分点,说明30Kc6基因的表达能够显著抑制高渗透压诱导的细胞凋亡。另外,实验发现在高渗透压条件下30Kc6基因的表达依然显著提高了细胞的抗体比生产速率,同时因其对高渗透压诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用,所以最终使培养过程的抗体产量获得大幅度提高。对于30Kc19基因的作用及其机制的研究,本文采用重组CHO细胞共表达30Kc19基因和在培养基中添加30Kc19蛋白两种方法进行。首先将30Kc19基因转染至表达典型糖蛋白EPO的重组CHO细胞,建立三株基因稳定表达的阳性细胞克隆和一株仅仅转染空载质粒、与原始重组细胞生长相似的阴性对照细胞克隆,并在12孔细胞培养板中进行贴壁培养。实验发现,在共表达30Kc19基因的重组CHO细胞培养上清中EPO产量增加了102.6%,比生产速率提高了146%。利用双向电泳免疫印迹法对EPO的唾液酸含量进行检测,发现共表达30Kc19基因的CHO细胞所合成的EPO亚基等电点与对照细胞表达的EPO相比明显从大约6.5向4.8处移动,说明EPO唾液酸含量也有显著提高。研究结果证实,30Kc19基因的表达一方面较好地维持了线粒体的膜电位,并促进ATP生成,通过强化翻译过程使EPO的比生产速率得以提高,另一方面它还改善了唾液酸转移酶的活性,从而提高EPO的唾液酸含量。为了进一步考察30Kc19基因的作用,实验将上述共表达30Kc19基因的阳性细胞克隆和阴性对照细胞克隆适应到无血清悬浮培养,结果表明共表达30Kc19基因的CHO细胞在悬浮培养过程中获得的EPO产量达到阴性对照细胞的2.5倍。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)对EPO蛋白N糖苷键连接糖基(N糖基)的糖基结构、唾液酸和岩藻糖含量进行定量分析,发现30Kc19基因表达细胞合成了具有2个、3个、4个和5个触角分支的N糖基,比例分别为35.12%、18.12%、33.14%和13.62%,而阴性对照细胞合成的主要是具有2个触角分支的N糖基,比例为70.00%。而且,30Kc19基因表达细胞所合成的N糖基中有52.89%添加了唾液酸,76.83%添加了岩藻糖,而阴性对照细胞合成的N糖基中没有检测到唾液酸,只有61.45%添加了岩藻糖。由此可见,30Kc19基因的表达使CHO细胞合成的EPO糖基结构更加复杂,且唾液酸和岩藻糖含量也更高。最后,本文利用大肠杆菌表达的30Kc19蛋白,将其纯化后添加到无血清培养基中,以考察添加的30Kc19蛋白对CHO表达的EPO产量及其唾液酸含量的作用。结果显示,无血清培养基中添加的0.2 mg/ml重组30Kc19蛋白,使EPO产量提高了41.6%,同时其亚基等电点也从大约6.2向4.6处移动,说明EPO蛋白的唾液酸含量也有明显增加。上述结果表明,不论是重组CHO细胞共表达30Kc19基因还是在其悬浮培养的无血清培养基中添加重组30Kc19蛋白,都能够提高EPO的产量及其唾液酸含量,但相比之下,通过基因工程改造的基因共表达方式更为有效。通过本文的大量实验研究,不仅认识了30Kc6基因对提高CHO细胞抗凋亡能力的作用,以及30Kc19基因对提高CHO细胞的目的产物表达能力及其糖基化水平的重要贡献,而且对它们的具体作用机制也给予了更加深入的剖析和揭示。同时,本文结果也证明,在重组CHO细胞中共表达30Kc6和30Kc19等来源于家蚕的30K基因,可望成为未来提高重组细胞株抗凋亡能力、促进目的产物表达并提高其糖基化品质等重组细胞株工程化改造的一种具有潜在应用价值的新途径。