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研究背景:血瘀即是离经之血未能及时排出或消散,停留于体内;或血液运行不畅,积于脏腑、器官、组织之内,失去正常生理功能而产生的证候,即为血瘀证。传统中医理论认为血瘀的产生与血与脉两个因素密切相关。一、血液滋润与濡养功能的发挥易受到寒、热、气滞、气虚等因素的影响,故《灵枢本藏》有“血和则经脉流行”的论述。此外传统中医尚有“津血同源”“汗血同源”“精血同源”等观点,认为汗液、津精液等可以互化互生。因此我们认为血瘀在一定程度上伴有水液停聚。二、“脉者,血之府”《素问脉要精微论》,脉既是血液化生的场所,又是血液运行的通道,因此脉道通利与否是血液能否畅通的前提和保证。现代研究证实微循环障碍有微血流异常(血),可改变微血流状态,使血液“粘稠”,而呈现血瘀的病理表现;其次存在微血管内皮细胞损伤(脉),血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VEC)是组织半透膜、衬贴于血管内侧面,属“脉”重要组成、与血紧密接触,对内环境稳定、组织血供与代谢调控非常重要。血管内皮细胞的损伤可以导致血管通透性改变,使血浆蛋白渗入组织间隙,组织液胶体渗透压升高,造成“水积”,即血瘀兼“水积”象,这与中医的“津血同源”“汗血同源”“精血同源”观点不谋而合。而以往治疗血瘀证多注重于血而忽视脉道损伤导致的水积,故本课题提出“水瘀”概念,创建“活血利水”法,并将其分为“活血消肿”和“活血利尿”两个方面在肺、肾组织体现。在《素问?调经论篇》“病在脉、调之血,病在血、调之络”理论指导下,将VEC作为改善微循环障碍的效应位点。水通道(Aquaporin,AQP)是一种与水通透性(吸收、分泌、转运)有关的细胞膜糖蛋白,维持细胞内外水平衡,AQP1选择性分布于内皮细胞(VEC)、上皮细胞等,在肺、肾组织均有表达。实验证实AQP1在血管生成和细胞迁移中发挥重要作用,AQP1有助于VEC修复。故AQP1可以作为“活血利水”法辨治微循环障碍的新指标。丹参作为传统的活血药,本文冀以探讨丹参是否可通过保护VEC以改善微循环障碍以及对AQP1的调节效应的关系进行研究。第一部分:丹参对急性微循环障碍大鼠血管内皮细胞的保护作用目的:1、验证盐酸肾上腺素及冰水刺激造成急性微循环障碍大鼠即血瘀证模型造模成功。2、观察血瘀证相关参数变化,验证丹参通过保护内皮细胞以改善微循环障碍。方法:50只SD雄大鼠随机分为两组,正常组10只,模型组40只,模型组采用腹部皮下注射盐酸肾上腺素和冰水泳刺激。造模成功的再分为:正常组、模型组、西药对照组、丹参低剂量、丹参中剂量组、丹参高剂量组。观察各组大鼠精神、毛发、舌质颜色等基本状态,剃耳部毛在微循环仪器检测耳部微小血管血液循环状态及检测血液粘度和红细胞变形能力确认微循环障碍即血瘀证模型造模成功;ELISA法检测大鼠血清中血管内皮素(ET-1)、P-选择素(P-Selection)、血管内皮生长因子(VEGF)含量。结果:丹参可以明显改善大鼠耳部微循环障碍并降低大鼠血液粘度;丹参显著减少ET-1、P-Selection、VEGF的含量。结论:丹参可以改善大鼠微循环障碍其机制与通过改善内皮细胞结构或者功能有关,并验证血管内皮细胞为血瘀证的效应位点。第二部分:丹参改善急性微循环障碍大鼠肺损伤及对肺组织AQP1调节作用目的:通过丹参对于微循环障碍大鼠肺组织损伤的改善及对AQP1表达的调节,验证丹参通过上调肺组织内皮细胞上AQP1的表达来减轻微循环障碍大鼠肺组织损伤及肺水肿。方法:取大鼠肺组织进行肺水肿参数的检测,肺湿/干比(W/D)和右肺/体重之比(R/B);HE染色法观察各组肺组织病理形态学变化;用Western blot检测方法分析各组大鼠肺组织AQP1的表达;运用免疫组织化学检测方法检测各组大鼠肺组织的AQP1表达。结果:肺湿/干比及右肺/体重之比提示:和正常组相比,模型组均显著升高(P<0.05)丹参中剂量、丹参高剂量和模型组相比均降低(P<0.05);HE染色结果:模型组具有急性肺组织损伤的表现,丹参具有明显的改善作用且随着剂量的增加肺组织结构越趋于正常;AQP1表达:在肺组织中,丹参低、中、高剂量组较模型组表达量均升高,且随着丹参剂量增高表达量增加明显。结论:丹参通过上调肺组织AQP1的表达来减轻微循环障碍大鼠急性肺组织损伤及肺水肿,并验证“血瘀证”亚型“水瘀”存在假说。第三部分:丹参改善急性微循环障碍大鼠肾损伤及对肾组织AQP1调节作用目的:通过丹参对微循环障碍大鼠肾组织损伤的改善及对AQP1表达的调节,验证丹参通过上调AQP1表达改善微循环障碍大鼠肾损伤所致的水液代谢障碍。方法:HE染色法观察各组肾组织病理形态学变化;用Western blot检测方法分析各组大鼠肾组织AQP1的表达;运用免疫组织化学检测方法检测各组大鼠肾组织的AQP1表达。结果:HE染色结果:模型组具有肾损伤的表现,丹参具有明显的改善作用且随着剂量的增加肾组织结构及功能越趋于正常;AQP1表达:在肾组织中,丹参低、中、高剂量组较模型组表达量均升高,且随着丹参剂量增高表达量增加明显。结论:丹参改善微循环障碍大鼠肾损伤所致的水液代谢障碍与通过上调AQP1表达有关,体现“活血利水”法在“水瘀”病症治疗中的重要性。小结:1、证实盐酸肾上腺素及冰水泳刺激大鼠血瘀证模型有微循环障碍表现。2、丹参通过降低血清ET-1、P-selection、VEGF含量保护血管内皮细胞以改善微循环障碍,并验证血管内皮细胞为血瘀证的效应位点。3、丹参对于急性微循环障碍造成的急性肺组织损伤及急性肾组织损伤均有改善作用可能与保护微血管内皮细胞有关。4、丹参通过上调肺组织AQP1对微循环障碍大鼠肺损伤及肺水肿指标的影响结果进一步验证“血瘀证”亚型“水瘀”存在假说,提示“活血消肿”法可为血瘀证的治疗大法。5、丹参通过上调肾组织AQP1对微循环障碍大鼠肾损伤所致水液代谢障碍的防治作用体现“活血利水”法在“水瘀”病症治疗中的重要性。