论文部分内容阅读
贻贝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein, MAP)是海洋软体动物贻贝(Mytilidae)足部的足丝腺分泌的一类具有粘性的蛋白质,也称贻贝足丝蛋白(Mussel foot protein, Mfp),强粘性主要取决于蛋白中的3,4-二羟基苯丙氨酸(3,4-Dihydroxyphenyl L-Alanine,德Dioxyphenyla-lanin简称多巴,DOPA)分子基团的含量。目前在组成足丝盘的粘蛋白类型中,Mfp-5中DOPA含量高达25-30%,粘性最强。贻贝粘蛋白无毒害、无免疫原性且生物相容性好,其粘性、防水性及耐腐蚀性高,应用范围广。现用的贻贝粘蛋白主要是天然获取,但是其易固化且含量低,难获得、成本高,制约了其应用。已有用原核表达(大肠杆菌Escherichia coli)及真核表达(巴斯德毕赤酵母Pichia pastor is)系统获得基因工程重组的贻贝粘蛋白,但是表达量或者粘附性能均不如意。植物基因工程的真核蛋白合成途径有较高级的蛋白糖基化和磷酸化等修饰,而且在规模化生产、安全性和生产成本方面也有较大优势。因此,我们尝试在植物中表达地中海贻贝粘蛋白Mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5)基因。以模式植物烟草(Nicotiana tabacum L.)为受体,在建立烟草遗传转化体系的同时,利用基因工程技术方法构建含有Mgfp-5基因的植物表达载体pRI101-Mgfp,农杆菌介导法转化烟草,优化转化的条件,筛选培养,得到转化植株。借助PCR、RT-PCR分子生物学方法鉴定外源基因的整合和转录,获得含有Mgfp-5基因的T,代转基因植株,再经SDS-PAGE分析、Western Blot鉴定,重组Mgfp-5蛋白可以在转基因烟草叶片中表达。所取得的主要研究结果如下：1.构建了含Mgfp-5基因植物表达载体pRI101-Mgfp,将其转入到农杆菌LBA4404:前期获得的pUC57-Mgfp载体(含有Mgfp-5基因和His-tag),设计引物将其一同克隆并嵌入植物表达载体pRI101-AN多克隆位点Nde I和Kpn I之间,构建含有Mgfp-5基因的植物表达载体pRI101-Mgfp。 PCR、酶切鉴定为正确的pRI101-Mgfp载体冻融法转入到农杆菌LBA4404中。2.建立了用于遗传转化的秦烟95(Nicotiana tabacum L. Qinyan95)离体再生体系：秦烟95叶片外植体在含有10 mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的MS培养基上培养约4周,可以100%诱导出长势好生长健壮的大量不定芽：幼芽在附加0.1 mg/L NAA的MS的培养基上,10d左右就可以100%诱导出健壮的根。3.农杆菌介导的转化中,优化了影响遗传转化频率的叶片预培养时间、菌液浓度、侵染时间以及共培养时间的条件：叶片外植体在预培养3 d、农杆菌菌液OD600=0.6、侵染10 min、共培养3 d,在附加20 mg/L的Kan浓度的选择压下可以获得转化植株。4.转化植株中gfp-5基因的鉴定,获得转基因植株：分子生物学PCR、RT-PCR分析转化植株,均检测到外源Mgfp-5基因的目标条带260 bp。检测的87株转化植株(T0代)中,外源基因gfp-5整合率为74.7%,表达率为39.1%。收获T0代种子,PCR、RT-PCR继续跟踪分析T1代抗性筛选的阳性小苗,gfp-5基因仍然可以在基因水平上稳定表达。T1代转基因植株中,Tris-饱和酚法提取叶片总蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blot鉴定,Mgfp-5蛋白可以在T1代转基因植株中表达。