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目的鼠双微体4(murine double minute4, MDM4)属于鼠双微体(murine double minute,MDM)基因家族，定位于人类染色体1q32，编码490个氨基酸。截短MDM4(splicing variant of MDM4, S-MDM4)是MDM4的变异体，与全长MDM4(full-length MDM4, FL-MDM4)在第6号外显子存在68bp缺失。鼠双微体2(murine double minute2, MDM2)是MDM4的类似物，两者在结构上具有高度的相似性。近年研究发现，MDM4基因在调节p53活性方面具有重要的作用，且在慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)中过表达。本研究目的旨在探索MDM4在CLL中的预后意义和研究MDM4在p53通路中的作用机制。方法采用实时定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction, qRT-PCR)技术、SYBR Green荧光染料法检测140例CLL患者外周血淋巴细胞中FL-MDM4、S-MDM4和MDM2基因表达水平，运用循环阈值(cyclethreshold, Ct)比较法进行MDM mRNA相对定量分析，上述基因的相对表达量以公式2(-△Ct)表示，其中△Ct=Ct目的基因-Ct对照基因。应用统计软件SPSS17.0对数据进行统计分析，不同分组间基因表达水平的差异采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。分析FL-MDM4、S-MDM4和MDM2mRNA表达水平与性别、年龄、Binet分期、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、胸苷激酶1(thymidine kinase1, TK1)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin, β2-MG)、免疫球蛋白重链可变区(immunoglobulin heavy-chain variable region, IGHV)基因突变状态、细胞遗传学异常、p53基因突变、p53异常、CD38和ZAP-70蛋白的关系。结果①140例CLL患者包括96例男性和44例女性患者(男性：女性=2.2)，中位发病年龄为61岁(33~84岁)。根据Benit分期，Benit A期49例(35.0%)，B期53例(37.9%)，C期38例(27.1%)。140例CLL患者外周血淋巴细胞中FL-MDM4、S-MDM4和MDM2的mRNA表达水平中位数分别为0.05274(0.1101~0.01342)、0.01689(0.03349~0.00645)和0.01172(0.02717~0.00539)；②p53异常定义为CLL患者伴del(17p13)和/或p53突变，在可统计的131例患者中，p53异常为28例(21.4%)。③FL-MDM4和S-MDM4mRNA表达水平在伴del(17p13)(P=0.037和P=0.006)、p53突变(P=0.023和P<0.001)和p53异常(P=0.024和P<0.001)的CLL患者中明显升高，但是并未发现MDM2与上述p53状态有相关性(P=0.196、P=0.095和P=0.092)。此外，S-MDM4表达水平在Binet分期较晚的患者，LDH水平增高和β2-MG水平增高的患者中明显升高。④无治疗生存时间(treatment free survival, TFS)定义为从诊断到首次治疗的时间或最后随访的时间。生存分析提示，S-MDM4高表达是确定TFS的不良预后因素。多因素Cox回归分析发现del(17p13)是与TFS明显相关的独立预后因素。结论CLL患者中，FL-MDM4和S-MDM4高表达提示患者伴p53异常。S-MDM4表达水平与CLL多种临床和生物学特征存在相关性，具有一定的预后意义。目的慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是一种异质性的恶性血液病，而化疗效果在一定程度上决定了患者的预后，氟达拉滨为目前治疗CLL常用药物，通过拮抗嘌呤代谢引起DNA损伤从而激活p53基因，使CLL细胞进入线粒体凋亡途径从而发挥其抗肿瘤作用。氟达拉滨活性物质(F-ara-A)的药理作用通过抑制DNA的合成，从而引起DNA的损伤和p53的活化。Nutin-3是鼠双微体2(murine double minute, MDM2)基因特异性的拮抗剂，阻止MDM2-p53的结合，从而解除MDM2对p53的抑制，使p53活化。全长鼠双微体4(full-lengthmurine double minute4, FL-MDM4)基因、截短鼠双微体4(splicing variant ofMDM4, S-MDM4)基因和MDM2基因均含有p53结合区(p53binding dormain，p53BD)，且通过该区与p53结合发挥作用。本研究使用氟达拉滨或Nutin-3体外处理CLL细胞，探CLL细胞凋亡与p53状态的关系，以及FL-MDM4、S-MDM4和MDM2在p53依赖的凋亡途径中的作用及地位。方法无菌分离22例CLL患者外周血中的CLL细胞进行体外培养，设立氟达拉滨、Nutin-3实验组及不含氟达拉滨和Nutin-3的对照组，培养24h后收集细胞。流式细胞术检测Annexin V-FITC/propidium iodide (PI)以明确凋亡程度；SYBRpolymerase chain reaction, qRT-PCR)方法检测FL-MDM4、S-MDM4和MDM2表达水平；间期荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术检测12三体、免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain, IgH)易位和6q23、11q22.3、13q14、17p13缺失；PCR联合DNA序列测定检测免疫球蛋白重链可变区(immunoglobulin heavy chain variable region, IGHV)基因突变和p53基因突变；流式细胞术检测CLL细胞内p53/p21蛋白水平以明确p53基因的功能状态。应用统计软件SPSS17.0对数据进行统计分析，实验组与对照组CLL细胞间凋亡水平及基因表达水平的差异性用配对的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果①单纯体外培养24h后CLL细胞的自发性凋亡(10.6%)较细胞分离时(6.0%)明显增加(P=0.004)；经氟达拉滨(n=22)或Nutin-3(n=16)培养24h后，CLL细胞凋亡显著高于对照组(P=0.001和P=0.001)。为进一步研究p53状态和CLL细胞凋亡的关系，将22例CLL患者分为p53正常(n=13)和p53异常(n=9)两组。p53基因正常定义为CLL患者不伴del(17p13)和p53突变。相反，p53基因异常定义为CLL患者伴del(17p13)和/或p53突变。p53基因正常的CLL细胞自发性凋亡、经氟达拉滨或Nutin-3处理后凋亡均较前增加(P<0.001和P=0.006)。而p53异常的CLL患者，处理前后凋亡未见明显增加。②p53功能正常定义为氟达拉滨处理CLL细胞后，采用流式细胞术检测p21蛋白，若升高升高，提示p53功能正常。在p53基因或p53功能正常CLL细胞，经氟达拉滨体外处理24h后，FL-MDM4表达水平明显下降(P=0.001和P=0.002)，但经Nutin-3处理后，其表达水平明显升高(P=0.008和P=0.011)。同样，S-MDM4经氟达拉滨体外处理24h后，表达较前升高(P=0.013和P=0.017)，经Nutin-3处理后未见明显变化。MDM2经氟达拉滨(P=0.030和P=0.007)或Nutin-3(P=0.018和P=0.038)体外处理24h后，mRNA的表达量明显增加。结论氟达拉滨和Nutlin-3诱导CLL细胞凋亡依赖正常功能的p53基因，S-MDM4可能是p53更有力的抑制因子和未来的药物靶点。