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第一部分TLR2/NADPH氧化酶通路在COM晶体-巨噬细胞反应中的作用目的:观察COM晶体-巨噬细胞反应中TLRs受体的表达情况,初步探讨TLRs-NADPH通路在COM晶体-巨噬细胞反应中的作用。方法:根据前期实验,选用500ug/ml COM晶体刺激巨噬细胞,利用Real-time PCR法检测细胞TLR2m RNA、TLR4m RNA、p47phoxm RNA与p91phoxm RNA基因相对表达量;利用流式细胞仪检测细胞膜蛋白TLR2表面受体的表达;利用Wester-blot法检测p47phox与p91phox蛋白表达情况;利用荧光酶标仪观察细胞内ROS表达情况。在巨噬细胞与COM晶体培养体系中给予NADPH氧化酶阻断剂Apocynin后,观察细胞内ROS表达情况。给予TLR2受体抑制剂后,利用Wester-blot法检测细胞p47phox蛋白的表达情况。结果:COM晶体刺激巨噬细胞后,TLR2m RNA表达明显升高(*P<0.01);TLR4m RNA表达未见明显变化(P>0.05);TLR2蛋白表达明显升高(*P<0.01);细胞内ROS明显升高(*P<0.01)。给予NADPH氧化酶阻断剂Apocynin干预后,细胞内ROS明显降低(*P<0.01)。给予TLR2受体抑制剂(FSL-1)后,p47phox蛋白的表达明显降低(P<0.05)。结论:巨噬细胞可能通过TLR2受体识别COM晶体或晶体结合的基质,进而激活NADPH氧化酶产生大量ROS。TLR2/NADPH氧化酶通路在草酸钙结石形成中可能发挥了重要作用。第二部分COM晶体通过NADPH氧化酶依赖性ROS生成诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的研究目的:观察COM晶体-巨噬细胞反应中NLRP3炎症小体表达情况,探讨NLRP3炎症小体的活化机制。评估阿托伐他汀对COM晶体-巨噬细胞反应中NLRP3炎症小体活化的影响。方法:在巨噬细胞与COM晶体共培养体系中,利用Real-time PCR法检测细胞NLRP3m RNA和Caspase-1m RNA基因相对表达量。利用Wester-blot法检测细胞NLRP3和Caspase-1蛋白的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中IL-1β、IL-18的蛋白表达情况。分别用NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin)、TLR2受体抑制剂(FSL-1)及药物阿托伐他汀预处理巨噬细胞后,利用Wester-blot法检测细胞NLRP3和Caspase-1蛋白的表达。结果:NLRP3和Caspase-1蛋白水平与m RNA表达量在COM晶体刺激巨噬细胞后均明显升高(*P<0.01);细胞上清液中IL-1β、IL-18表达明显升高(*P<0.05)。给予NADPH氧化酶抑制剂、TLR2受体阻滞剂或阿托伐他汀干预后,NLRP3及Caspase-1的活性蛋白P20的表达明显降低(*P<0.05)。结论:COM晶体刺激巨噬细胞NLRP3炎症小体激活。COM晶体通过NADPH氧化酶依赖性ROS生成诱导巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化。阿托伐他汀能够抑制COM晶体诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活。第三部分COM晶体刺激巨噬细胞NLRP3-HMGB1炎症信号通路作用的研究目的:观察细胞培养液中HMGB1的表达情况,探讨NLRP3-HMGB1炎症信号通路在晶体-巨噬细胞炎症反应过程中的作用。方法:利用Real-time PCR法检测细胞HMGB1m RNA基因的相对表达量。利用Wester-blot法检测细胞培养液上清中HMGB1蛋白的表达情况。使用RNA干扰技术,将NLRP3-Si RNA转染巨噬细胞后,利用Wester-blot法检测细胞培养液上清中HMGB1蛋白的表达。结果:COM晶体刺激巨噬细胞后,细胞培养液中HMGB1的表达明显升高(*P<0.05)。NLRP3-Si RNA转染巨噬细胞后,HMGB1的表达明显降低(*P<0.01)。结论:COM晶体刺激巨噬细胞HMGB1的释放,NLRP3-HMGB1炎症信号通路在COM晶体-巨噬细胞炎症反应中发挥了重要作用。