研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是世界范围内严重危害人类健康的常见和多发疾病,当前其发病机制未明,防治形势非常严峻。气道粘液高分泌是除慢性气道炎症和肺气肿夕hCOPD的又一特征性病理改变,是COPD发病率和死亡率升高的独立危险因素,因此气道粘液高分泌的发生机制研究,已成为COPD防治领域的关注热点。多种与COPD发病密切相关的因素,如香烟烟雾、病原微生物及其产物(如脂多糖、绿脓菌素),炎症细胞(如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞)及炎症因子(如IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-4)等,可直接或间接作用于气道上皮细胞,在气道粘液高分泌的形成和维持中发挥重要作用。相关的机制研究表明,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在上皮细胞的粘液分泌过程中发挥重要介导作用,而在其下游诸多信号分子中,MAPK家族成员ERK占据了非常重要的地位,可形成EGFR-ERK通路。另外,金属蛋白酶家族的某些成员也参与到粘蛋白MUC5AC(气道粘液的一种主要大分子成分)的诱导过程中,如细胞膜上的肿瘤坏死因子α转换酶(TNF-a converting enzyme, TACE)可剪切锚定在胞膜表面的pro-TGF-a, pro-amphiregulin, pro-HB-EGF等前体分子,释放出可溶性的活性成分TGF-a, amphiregulin (AR)和HB-EGF,这些活性成分作为EGFR的配体与之结合,通过配体-受体反应转激活EGFR及下游信号通路,促进粘蛋白的合成和分泌。在香烟提取物(cigarette smoke extract, CSE)、中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase,HNE)、活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)>脂多糖和绿脓菌素、曲霉菌等诱导气道上皮细胞粘蛋白生成的过程中,TACE介导的EGFR转激活作用已得到证实。近年来,天然免疫系统在COPD发病中的作用受到重视。Cathelicidin是人类内源性抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)的重要成员,是天然免疫系统的重要组成部分,广泛表达于机体多种组织。Cathelicidin具有多种生物学功能,除具有针对细菌、真菌、病毒等的抗微生物活性外,还在炎症／免疫反应、损伤修复、细胞增殖和凋亡等病理生理过程中发挥重要的调控作用。人们注意到,Cathelicidin的调控活性与COPD发病的多个病理环节有较好的契合,推测Cathelicidin可能在COPD的发病中占有一定地位。相关研究表明,COPD患者诱导痰、肺组织、支气管肺泡灌洗液以及呼吸道上皮衬液中LL-37(Cathelicidin发挥作用的活性片段)的表达均显著升高,提示LL-37与COPD的发病密切相关；我们的前期研究则发现,LL-37能诱导气道上皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡并伴随IL-8、TNF-a等炎症因子的释放,提示LL-37可能在COPD发病的气道炎症和肺气肿形成两个病理过程中发挥作用。然而,对于COPD的气道粘液高分泌过程,LL-37是否在其中发挥作用尚不得而知。有文献报道,LL-37可通过转激活EGFR-ERK信号通路,活化气道上皮细胞,促进炎症因子IL-8的释放；LL-37还可通过MAPK途径上调人结肠上皮细胞粘蛋白基因的表达,增加粘蛋白合成。根据LL-37在COPD患者气道内的高表达状态以及LL-37激活相关信号通路的能力,我们提出假设,推测气道局部高水平的LL-37能够促进气道粘蛋白的生成,从而参与气道粘液高分泌状态的形成,并因此在COPD的发病及病情进展中发挥重要作用。为验证这一假设,本研究在人体标本和体外细胞两个层面探讨了LL-37对COPD气道粘液分泌的影响及其可能的分子机制。目的观察COPD患者小气道局部内源性抗菌肽Cathelicidin/LL-37和粘蛋白的表达情况,探讨Cathelicidin/LL-37对人气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC的体外诱导效应及相关分子机制,初步阐明Cathelicidin/LL-37在COPD气道粘液高分泌中的作用。方法1.研究对象和一般资料收集选取因肺外周肿瘤需行肺叶切除术的稳定期COPD患者15例(COPD group)、肺功能正常的吸烟者15例(Normal Smoker group,NS group)和肺功能正常的不吸烟者15例(Normal Non-smoking group, NN group),术前收集性别、年龄、吸烟史等一般资料,并行常规肺通气功能检查,记录一秒量(forced expiratory volume in1sec,FEV1)和一秒率(FEV1/forced volume capacity, FEV1/FVC)。 COPD诊断的确立根据GOLD (2010)标准。2.人体组织病理研究术中收集手术切除的外周肺组织,距肿瘤边缘5cm以上,以排除肿瘤的影响。对肺组织切片进行HE染色、糖原过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain, PAS)染色和免疫组织化学染色,比较3组标本的形态学特征以及外周小气道上皮LL-37和粘蛋白MUC5AC的表达情况,分析LL-37、粘蛋白MUC5AC与肺通气功能指标,以及LL-37与粘蛋白MUC5AC之间的相关性。3.体外研究3.1体外培养人支气管上皮NCI-H292细胞,香烟提取物(cigarette smoke extract, CSE)和LL-37合成肽分别以不同刺激浓度、不同刺激时间作用于细胞,MTT法检测CSE和LL-37合成肽对细胞活力的影响,选取细胞活力不低于80%的刺激模式为后续实验提供参考范围。3.2LL-37合成肽以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞,收集培养液上清和细胞裂解物,用ELISA分别检测其中粘蛋白MUC5AC含量,同时BCA法检测细胞裂解物中总蛋白含量。粘蛋白MUC5AC总量计算公式为：(上清中MUC5AC含量+细胞裂解物中MUC5AC含量)／细胞总蛋白含量。为比对LL-37作用的特异性,乱码LL-37(scramble LL-37, sLL-37)合成肽以相同的作用模式刺激细胞,检测粘蛋白MUC5AC生成的总量。3.3在培养体系中有CSE (0.005cig/ml)存在的情况下,LL-37合成肽和sLL-37合成肽分别以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞,ELISA检测细胞粘蛋白MUC5AC生成的总量。3.4在培养体系中有和无CSE (0.005cig/ml)存在的情况下,LL-37合成肽以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞,ELISA检测培养上清中IL-8的水平；以重组人IL-8单独刺激NCI-H292细胞,或经IL-8中和抗体预处理细胞后再给予LL-37合成肽刺激,ELISA检测粘蛋白MUC5AC生成的总量。3.4CSE以不同作用浓度刺激NCI-H292细胞,免疫荧光染色后激光共聚焦扫描检测LL-37在细胞中的表达范围和强度,同时ELISA检测上清液中LL-37的含量。3.5LL-37合成肽以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞,收集上清和细胞裂解物,ELISA检测上清中TGF-a的含量,Western blotting检测细胞裂解物中ERK、EGFR的磷酸化水平,荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)检测细胞的TACE活性。3.6用TACE抑制剂TAPI-1, EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478, ERK上游MEK分子的抑制剂U0126,以及TGF-a中和抗体、EGFR中和抗体、AR中和抗体和HB-EGF中和抗体等预处理NCI-H292细胞后,再给予LL-37合成肽刺激,检测步骤3.5中相应的指标。3.7LL-37合成肽刺激NCI-H292细胞后,利用荧光探针DCF-DA检测胞内活性氧(ROS)水平；用抗氧化剂DMTU和nPG预处理NCI-H292细胞后再给予LL-37合成肽刺激,FRET检测细胞TACE活性,ELISA检测粘蛋白MUC5AC总的生成量。3.8用蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制剂Staurosporine预处理NCI-H292细胞后再给予LL-37合成肽刺激,FRET检测细胞TACE活性,ELISA检测粘蛋白MUC5AC生成的总量。结果1.一般资料比较3组研究对象在年龄和性别比例上无显著性差异(均P>0.05),COPD组的FEV1%较肺功能正常吸烟组和肺功能正常不吸烟组明显降低(均P<0.05),肺功能正常吸烟组和COPD组的吸烟史(吸烟指数)无显著性差异(P>0.05)。2.人体组织病理学研究HE染色结果显示,COPD组小气道局部炎症征象比较明显,上皮完整性破坏；肺功能正常不吸烟组小气道无明显炎症征象,上皮保持完整；肺功能正常吸烟组小气道的形态特征介于前两组之间。糖原PAS染色结果显示,COPD组小气道上皮染色非常明显,杯状细胞数明显增多；肺功能正常不吸烟组小气道上皮未见明显染色,杯状细胞数很少；肺功能正常吸烟组小气道上皮也有较明显染色,杯状细胞数增多,但少于COPD组。PAS染色面积百分比在COPD组最高,肺功能正常不吸烟组最低,肺功能正常吸烟组介于前两组之间(均P<0.05)。免疫组化染色结果显示,LL-37和MUC5AC的着色部位主要位于COPD患者外周小气道上皮内,其中LL-37分布广泛,位于纤毛细胞、杯状细胞等多种细胞内,而粘蛋白MUC5AC分布较单一,主要位于杯状细胞内。LL-37和粘蛋白MUC5AC染色强度的变化趋势相似,都是在COPD组最高,肺功能正常不吸烟组最低,肺功能正常吸烟组介于两组之间(均P<0.05)。相关性分析表明,小气道上皮中LL-37和粘蛋白MUC5AC的表达均与肺功能指标FEV1%呈显著负相关(分别有r=-0.606, P<0.01; r=-0.641, P<0.01),而LL-37与粘蛋白MUC5AC呈显著正相关(r=0.776,P<0.01)。3.体外研究3.1细胞活力的MTT检测结果显示,LL-37合成肽在0-10μg/ml的浓度范围内刺激细胞24h, NCI-H292细胞活力不低于80%；CSE在0-0.015cig/ml的浓度范围内刺激细胞24h, NCI-H292细胞活力不低于80%。3.2LL-37合成肽单独刺激NCI-H292细胞可诱导粘蛋白MUC5AC的生成,并呈明显的浓度-效应和时间-效应关系(均P<0.05)；在CSE (0.005cig/ml)存在的情况下,LL-37合成肽能以同样的作用模式诱导粘蛋白MUC5AC的生成,且诱导效应较LL-37合成肽单独刺激时更强(均P<0.05)。sLL-37合成肽对NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC的生成无明显影响(P>0.05)。3.3LL-37合成肽单独刺激NCI-H292细胞可诱导NCI-H292细胞释放IL-8,并呈明显的浓度-效应和时间-效应关系(均P<0.05)；在CSE (0.005cig/ml)存在的情况下,LL-37合成肽能以同样的作用模式诱导IL-8的释放,且诱导效应较LL-37合成肽单独刺激时更强(均P<0.05)；重组人IL-8可刺激NCI-H292细胞生成粘蛋白MUC5AC,而IL-8中和抗体预处理细胞可显著抑制LL-37合成肽诱导的粘蛋白MUC5AC生成(均P<0.05)。3.4CSE刺激可诱导气道上皮NCI-H292细胞LL-37表达上调。激光共聚焦扫描图像显示,经CSE刺激后细胞中LL-37呈强阳性表达；ELISA结果显示,经CSE刺激后培养液上清中LL-37含量也明显增加,且这种增加依赖于CSE的刺激浓度(均P<0.05)。3.5LL-37合成肽可诱导ERK和EGFR磷酸化。当刺激时间为15min时,ERK的磷酸化达到峰值水平,在这一时间点,LL-37对ERK和EGFR磷酸化的诱导呈明显的剂量-效应关系。EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478可抑制LL-37合成肽诱导的EGFR、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成(均P<0.05)；EGFR中和抗体(Ab-3)和ERK抑制剂U0126可抑制LL-37合成肽诱导的ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成(均P<0.05)；AR中和抗体和HB-EGF中和抗体对LL-37合成肽诱导的EGFR磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成无明显影响(均P>0.05)。3.6LL-37合成肽可浓度和时间依赖性地诱导NCI-H292细胞TACE活化,酶活性的非线性拟合结果表明,细胞TACE活性在刺激6h时达到峰值(P<0.05),其后直至24h,大致保持稳定(均P>0.05)。在刺激粘蛋白MUC5AC生成的同时,LL-37合成肽还能同步诱导气道上皮细胞产生TGF-a,且也呈明显的浓度-效应和时间-效应关系(均P<0.05)。TACE选择性抑制剂TAPI-1可抑制LL-37合成肽诱导的TGF-a释放、EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的产生(均P<0.05)；TGF-a中和抗体和EGFR中和抗体可抑制LL-37合成肽诱导的EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的产生(均P<0.05)；EGFR中和抗体可增加LL-37诱导的TGF-a水平(P<0.05)。3.7LL-37合成肽对NCI-H292细胞内ROS水平无明显影响(P>0.05)；抗氧化剂DMTU和nPG对LL-37合成肽诱导的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成无明显影响(均P>0.05)；PKC抑制剂Stauropsorine对LL-37合成肽诱导的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成也无明显影响(均P>0.05)。结论1.COPD患者外周小气道上皮中Cathelicidin/LL-37和粘蛋白MUC5AC均呈高表达状态,且二者密切相关；2.Cathelicidin/LL-37可诱导人气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC的产生,在香烟烟雾作用下,这种诱导效应更强；3.Cathelicidin/LL-37诱导粘蛋白MUC5AC生成的机制可能涉及TACE-TGF-a-EGFR-ERK信号通路的激活,IL-8也在其中发挥了重要作用。4.COPD患者外周小气道内高表达的Cathelicidin/LL-37可直接和间接促进气道粘液高分泌状态的形成,进而在COPD发病及病情进展中发挥作用。