神经干细胞特异性启动子调控能力的研究

来源 :徐州医学院 徐州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wenshi_shen
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目的:研究能够调控外源基因在神经干细胞中特异性表达的启动子。  方法:PCR扩增出小鼠Nestin启动子全序列(4000bp)、核心序列(400bp)和内含子-2;以pcDNA3.1为模板,构建6种重组质粒,分别用CMV、CMV+内含子-2、Nestin启动子全序列、Nestin启动子全序列+内含子-2、Nestin启动子核心序列、Nestin启动子核心序列+内含子-2作为启动子调控报告基因EGFP表达;6种重组质粒分别转染Nestin+、Nestin-细胞,荧光显微镜下观察转染后细胞内EGFP表达,同时采用流式细胞仪法测定细胞EGFP表达率。用Nestin启动子核心序列与内含子-2序列融合作为启动子,构建慢病毒载体,感染神经干细胞,检测启动子在神经干细胞中调控能力。RT-PCR获得小鼠IGF-1基因的cDNA,构建IGF-1基因重组表达质粒,转染COS-7细胞,ELISA、Western blot检测其表达,进一步验证相关启动子调控真核基因的能力。经质粒抽提、酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定获取克隆的IGF-1重组质粒。  结果:经测序鉴定,克隆出的Nestin启动子序列、内含子-2与Genbank中公布序列一致。酶切鉴定结果显示构建的重组质粒完全正确。Nestin启动子全序列及核心序列都能非特异性调控EGFP基因在细胞内表达,并且具有较强调控能力;与内含子-2融合后,只能特异性调控EGFP基因在Nestin+细胞和神经干细胞内表达,CMV启动子与内含子-2序列融合只具有非特异性调控能力。克隆的IGF-1基因cDNA测序与Genbank公布序列一致,Nestin启动子核心序列和内含子-2融合后,能够调控IGF-1在COS-7细胞中表达。  结论:Nestin启动子全序列以及核心序列与内含子-2能分别协同调控外源基因在Nestin+细胞特异性表达。序列融合后,能够作为特异性调控外源基因在神经干细胞内表达的启动子。
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