本研究以雄性重要生殖器官睾丸及前列腺为研究对象，通过体内及体外染毒后检测组织及细胞中的MC-LR，观察其分布状况并确定其作用的靶细胞。另外，前列腺作为雄性最大的附属性腺，对维持雄性正常生殖功能起重要作用。基于此，本研究以MC-LR染毒后导致前列腺上皮细胞miRNA表达谱发生变化作为切入点，通过体内、体外实验及临床样本检测，进一步探讨MC-LR雄性生殖毒性的机制。　　第一部分 MC-LR染毒后在雄性重要生殖器官及其细胞中的分布研究　　目的：　　通过体内及体外实验，探究MC-LR染毒后在睾丸和前列腺中的分布状况及其作用的靶细胞。　　方法：　　1.12只雄性SD大鼠（35-40克）随机分为2组（MC-LR染毒组与空白对照组）。　　2.分别将睾丸及前列腺组织固定后，冰冻切片，利用免疫荧光法检测MC-LR;提取组织中总蛋白，利用western blot技术检测组织中的MC-LR含量;化学方法提取组织中的MC-LR，利用液质联用(LC-MS)技术检测组织中MC-LR的含量。　　3.利用已建立的原代细胞培养体系，分别取雄性SD大鼠睾丸中精原细胞、支持细胞及间质细胞进行体外培养，分别以500nM MC-LR染毒三种细胞，免疫荧光技术分别检测细胞中的MC-LR。　　4.利用培养的人前列腺上皮RWPE-1细胞系及基质WPMY-1细胞系，分别以500nM MC-LR染毒两种细胞，免疫荧光技术分别检测细胞中的MC-LR。　　结果：　　1.与对照组相比，睾丸及前列腺重量无明显差异;免疫荧光检测发现MC-LR可进入大鼠睾丸及前列腺组织，MC-LR在睾丸组织中主要分布在曲细精管管壁，睾丸间质中几乎未见分布;MC-LR在前列腺组织中主要分布于腺泡壁周围，基质中有少量分布，腺泡腔中未见分布;western blot检测发现，睾丸及前列腺组织中均可检测到MC-LR存在;LC-MS检测发现，睾丸及前列腺组织的提取物中均可检测到MC-LR。　　2.体外培养的三种睾丸功能细胞经MC-LR染毒，免疫荧光检测发现，MC-LR能够进入精原细胞和支持细胞，而不能进入睾丸间质细胞;而体外培养的两种前列腺功能细胞经MC-LR染毒，免疫荧光检测发现，MC-LR能够进入上皮细胞和基质细胞。　　结论：　　1.MC-LR急性染毒动物后，对睾丸及前列腺重量并无明显影响。　　2.MC-LR染毒动物后，可以进入睾丸组织及前列腺组织，主要分布于睾丸曲细精管管壁周围及前列腺腺泡壁周围。　　3.MC-LR体外染毒三种睾丸功能细胞后，可以进入精原细胞及支持细胞，无法进入间质细胞;其染毒两种前列腺功能细胞后，可以进入上皮细胞及基质细胞。　　第二部分 MC-LR对前列腺上皮细胞miRNA表达谱的影响及其相关机制研究　　目的：　　通过MC-LR染毒体外培养的人前列腺上皮RWPE-1细胞系，探讨其对上皮细胞miRNA表达谱的影响，筛选与上皮细胞功能相关的miRNA及其靶基因。　　方法：　　1.体外培养人前列腺上皮RWPE-1细胞系，利用CCK-8法检测细胞活力变化。　　2.根据MC-LR染毒后细胞活力检测结果，以不同浓度(0，10，100，500，1000nM)的MC-LR染毒前列腺上皮RWPE-1细胞48h后，利用FDA/PI双染技术观察细胞存活率变化。　　3.以500nM MC-LR染毒前列腺上皮细胞48h后，采用高通量microarray芯片筛选表达差异的miRNA，并采用qPCR技术验证芯片筛选结果的可靠性。　　4.利用miRBase及TargetScan等数据库，针对经MC-LR染毒后表达差异最为显著的miRNA，检索其相关靶基因。　　5.针对筛选出的目标miRNA及其潜在靶基因，构建分别含靶基因野生型、突变型序列或空载的双荧光素酶报告基因质粒。　　6.针对目标miRNA及其调控的靶基因，设计miRNA的过表达及抑制性慢病毒。　　结果：　　1.以不同浓度的MC-LR对前列腺上皮RWPE-1细胞染毒不同时间后，利用CCK-8法及FDA/PI双染法检测细胞活力及存活率变化，发现500nM染毒48h时细胞活力显著下降而细胞存活率较好，因而选择此方式为筛选表达变化miRNA的染毒方式。　　2.高通量microarray芯片结果显示，经MC-LR作用后，前列腺上皮细胞中共30种miRNA表达出现显著变化，其中26种显著上调而4种显著下调，qPCR验证显示了芯片结果的可靠性。　　3.生物信息学分析显示，上调最为显著的miRNA-4458存在潜在靶基因DAPK1;双荧光素酶报告基因检测发现，miRNA-4458与潜在靶基因DAPK1存在相互结合关系。　　4.将miRNA-4458的过表达及抑制性慢病毒转染后，检测靶基因DAPK1表达，显示miRNA-4458能够抑制DAPK1基因表达，MC-LR能够促进miRNA-4458对DAPK1基因表达的抑制作用。　　结论：　　1.MC-LR染毒前列腺上皮细胞后，可引起细胞活力及细胞存活率下降，并呈现时间及剂量依赖效应。　　2.MC-LR能够引起前列腺上皮细胞miRNA表达谱发生改变，30种miRNA表达发生显著变化，其中26种上调而4种下调，其中miRNA-4458上调最为显著。　　3.在前列腺上皮细胞中，miRNA-4458对DAPK1基因的表达具有抑制作用，MC-LR能够促进这种抑制作用。　　第三部分 MC-LR诱发前列腺肿瘤的相关机制研究　　目的：　　通过在临床前列腺癌组织样本中，研究miRNA-4458与其靶基因DAPK1的表达水平，以及两者表达与临床病理指标的相关性;并在前列腺癌细胞系及前列腺癌细胞荷瘤裸鼠中，研究miRNA-4458及其靶基因DAPK1表达改变后肿瘤细胞增殖与凋亡、迁移与侵袭等生物学行为变化及相关细胞信号转导通路的变化，探讨MC-LR诱发前列腺癌的可能机制。　　方法：　　1.收集24对临床前列腺癌根治术切除组织及其对应癌旁组织，利用qPCR、免疫组化及western blot等技术检测miRNA-4458及DAPK1基因表达水平，比较miRNA-4458及DAPK1基因在肿瘤及癌旁组织中的表达差异及两者表达的相关性。　　2.利用体外培养的前列腺上皮RWPE-1及PC-3、DU-145、22RV1、LNcaP等四种前列腺癌细胞系，通过qPCR技术检测各种细胞中miRNA-4458的表达水平。　　3.构建miRNA-4458的过表达及抑制性慢病毒，体外培养前列腺癌PC-3和DU-145细胞系，将慢病毒转染进入两种前列腺癌细胞系。　　4.体外培养前列腺癌DU-145细胞系，将miRNA-4458抑制性慢病毒转染进入细胞系。将肿瘤细胞皮下注射裸鼠，14天后处死裸鼠并计算瘤体体积，以检测miRNA-4458表达下调在体内对前列腺癌细胞生长的影响;将肿瘤细胞尾静脉注射裸鼠，42天后处死并观察裸鼠肺转移情况，以观察miRNA-4458表达下调在体内对前列腺癌细胞转移的影响。　　结果：　　1.临床前列腺癌组织样本中，miRNA-4458在肿瘤组织中的表达较癌旁组织中显著升高，且其表达与其调控的靶基因DAPK1呈负相关关系;miR-4458的表达与前列腺癌分期及淋巴结转移呈现相关性，显示其表达随肿瘤进展而呈现上调趋势。　　2.在体外培养的PC-3、DU-145、22RV1、LNcaP等四种前列腺癌细胞系中，miRNA-4458的表达相比前列腺上皮RWPE-1细胞均呈现上调，且在PC-3和DU-145两种细胞中最为明显。　　3.在体外培养的前列腺癌PC-3及DU-145细胞系中，上调miRNA-4458可促进细胞增殖而抑制细胞凋亡，而下调miRNA-4458则会抑制细胞增殖而促进细胞凋亡，其机制是通过调控细胞增殖相关通路中cyclin D1及CDK4等分子的表达;同时，上调miRNA-4458可促进细胞迁移与侵袭，而下调miRNA-4458则会抑制细胞迁移与侵袭，其机制是通过调控细胞侵袭相关通路中VEGF及MMP-2等分子的表达。　　4.将前列腺癌细胞皮下注射裸鼠后，促进miRNA-4458表达对肿瘤生长存在促进作用，反之则抑制肿瘤生长;而将前列腺癌细胞尾静脉注射裸鼠后，促进miRNA-4458表达对肿瘤转移存在促进作用，反之则抑制肿瘤转移。　　结论：　　1.临床前列腺癌样本中，miRNA-4458表达升高，DAPK1基因表达降低，并与前列腺癌进展及转移呈现相关性。　　2.在体外细胞水平，miRNA-4458可通过抑制DAPK1基因表达，间接激活cyclinD1及CDK4等分子所在的增殖相关通路，从而促进前列腺癌细胞增殖并抑制其凋亡。　　3.在体外细胞水平，miRNA-4458可通过抑制DAPK1基因表达，间接激活VEGF及MMP-2等分子所在的侵袭相关通路，从而促进前列腺癌细胞迁移与侵袭。　　4.在裸鼠体内，促进miRNA-4458表达对前列腺癌细胞的增殖与转移存在促进作用，反之则存在抑制作用。