海洋含有丰富的蛋白质、几丁质等生物质,其中几丁质是自然界中除纤维素外的第二大生物质。随着水产养殖业的迅速发展,水产品加工业每年都会产生大量的废弃物,尤其是甲壳类动物的外壳。以虾为例,虾有50%以上的部分不能被直接食用,仅广东省每年虾加工产业产生的废弃虾壳就有几十万吨。这些废弃物通常被扔到垃圾堆或海洋中,造成了严重的环境污染与资源浪费。废弃物制成的虾壳粉,含有约50%的蛋白质、20%的几丁质以及天然抗氧化剂虾青素等有价值的组分,然而这些组分在虾壳中相互紧密结合,不能有效被动物消化吸收利用,因此虾壳粉价格仅为450元/吨,远低于营养价值相当的鱼粉(10,000元/吨)。传统的强酸碱等理化加工工艺抛弃了虾壳中的蛋白质和其他有价值组分,会造成严重的污染和浪费。蛋白酶、几丁质酶水解虾壳是其高值利用最有效且环境友好的技术,目前因缺乏高效的蛋白酶及几丁质酶成为该技术的瓶颈。本课题使用毕赤酵母和枯草芽孢杆菌表达系统进行蛋白酶与几丁质酶基因的异源表达,得到了酶活较高的5个酸性蛋白酶及1个几丁质酶,分别为来源于哈茨木霉的P6281(321.8 U/m L),来源于热带假丝酵母的Candidapepsin,来源于近平滑假丝酵母的SAPP1,来源于卷枝毛霉的Saccharopepsin和类凝乳酶M3,以及来源于哈茨木霉的几丁质酶Chit46(31.4 U/m L),并通过镍柱亲和层析纯化后对P6281和Chit46的酶学性质等进行了分析研究。酶产量在同类文献中处于较高水平,为后续应用打下基础。本课题对制备的蛋白酶及几丁质酶对虾壳废弃物的水解效果进行了研究,结果表明酸性蛋白酶P6281及Saccharopepsin对虾壳蛋白的水解效果最好。使用分步酶解对虾壳废弃物中的蛋白质进行回收,在最优条件下,虾壳蛋白的回收率达到91.8%。对虾壳蛋白水解产物的氨基酸组成进行分析,其必需氨基酸含量分别为45.1%和49.1%。脱蛋白后的虾壳使用几丁质酶Chit46处理,在最优条件下,几丁质的回收率达到88.9%。对几丁质水解产物的成分进行分析,发现其中含有聚合度2-6及其他3个聚合度更大的几丁寡糖。去除蛋白质和几丁质后的虾壳再使用乙酸乙酯抽提取,可以很容易地从中提取出虾青素,提取产物具有很强的抗氧化性。该酶解工艺避免了传统工艺中盐酸和氢氧化钠的大量使用,减少了对环境的污染,而且温和的反应条件避免了对虾壳中各成分结构和活性的破坏。在上述虾壳废弃物回收处理的基础上,本课题进一步对几丁质酶进行了改造,把来源于枯草芽孢杆菌糖苷酶的多糖结合域融合到Chit46上。成功制备了3个融合几丁质酶,融合几丁质酶的比酶活和底物结合活性获得了显著的提高,并且能直接水解虾壳废弃物,而无需先经过酸性蛋白酶预处理,打破了大部分几丁质酶不能直接处理虾壳的限制。制备的水解物是一个良好的碳氮源,能很好地支持微生物生长。体外模拟消化实验表明水解剩余物的消化率远远高于虾壳粉,处理后的虾壳废弃物的营养价值获得了提升。综上所述,本课题在制备得到高活性酸性蛋白酶及几丁质酶的基础上,对南美白对虾虾壳废弃物的回收利用进行了研究,建立了一套虾壳废弃物综合利用的绿色工艺,避免了传统工艺中强酸强碱试剂的使用,具有很大的经济和实用价值。