论文部分内容阅读
化学结构复杂、生物活性多样的真菌天然产物,是潜在新药的重要来源,如免疫抑制剂霉酚酸,降胆固醇药物洛伐他汀,抗真菌药物灰黄霉素等都已应用于临床。来源于植物和微生物的二苯醚类天然产物虽然具有共同的联苯醚核心骨架,但是苯环上取代基团的千差万别可赋予其广泛且良好的,诸如抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等生物活性。因此,二苯醚类天然产物是新药开发最重要的骨架类型之一。真菌是二苯醚类天然产物主要来源之一,按照苯环上取代基的不同主要分为羟基二苯醚,溴代二苯醚和氯代二苯醚等。前期的研究阐明了第一个来源于真菌二苯醚类天然产物pescthic acid的生物合成途径,共12步,其中包含了一个铜离子依赖的氧化酶催化的聚酮骨架重排反应。除此而外,目前还没有来源于真菌二苯醚类天然产物生物合成途径的其它研究报道。在本文中,我们关注真菌中结构最简单,但分布最广泛的二苯醚类化合物Diorcinol及其衍生物。Diorcinol（3,3-二羟基-5,5-二甲基二苯醚）拥有对称的化学结构,具有良好的生物活性,其不但对金黄色葡萄球菌、结核分歧杆菌、白色念珠菌等均具有抑菌作用,而且还具有抗肿瘤活性、溶血活性。进一步的研究表明,diorcinol还能抑制amyloidβ-peptides 42(Aβ42)的聚集,可以作为治疗阿兹海默症的候选化合物。因此,diorcinol简短生物合成途径的阐明,不但可以丰富真菌二苯醚类天然产物的生物合成机制,而且为后续通过合成生物学和代谢工程方法,获得结构更复杂、活性更显著的diorcinol衍生物提供基础。Clay.C.C.Wang课题组前期通过体内基因敲除实验,在Aspergillus nidulans FGSC A4中鉴定了diorcinol生物合成相关基因（ors基因簇）。基因AN7909（orsA）的缺失菌株并不再具有苔色酸（orsellinic acid）和diorcinol的生产能力;AN7911（orsB）缺失株里累积了化合物gerfelin和C10-deoxy gerfelin;AN7912（orsC）、AN7913（orsD）和AN7914（orsE）的缺失,均对diorcinol的生物合成没有影响。该结果表明,AN7909和AN7911与diorcinol的产生直接相关,而其它基因并不参与其合成。但是,ors基因簇中的AN7910的功能及其与diorcinol生物合成的相关性,在体内敲除实验中并未涉及。生物信息学分析表明,AN7909是真菌非还原型聚酮合酶,含有SAT-KS-PT-ACP1-ACP2-TE结构域,推测其可以催化1分子的乙酰辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A生成苔色酸;AN7911属于酰胺水解酶超家族蛋白;而AN7910是一个未知功能蛋白,属于核转录因子2（nuclear transport factor 2,NTF2）超家族蛋白,结构域分析其含有SnoaL4结构域。但是AN7909、AN7910和AN7911的具体催化活性,及其在diorcinol生物合成的功能,仍缺乏证实。因此,本课题试图通过酵母系统异源表达及其酶学体外生化表征等实验研究AN7909,AN7910,AN7911的功能,从而探究diorcinol的生物合成途径。本课题获得如下主要结果:（1）通过酵母系统异源表达平台,成功共表达AN7909,AN7910和AN7911三个基因,获得diorcinol;（2）AN7909是一个特殊的非还原型聚酮合酶,在酵母和原本构巢曲霉中的高表达工程菌均主要生成二苯醚类化合物diorcinolic acid,而不是苔色酸;（3）点突变实验证实,AN7909蛋白结构域中的ACP1和TE结构域和diorcinolic acid的生成直接相关;（4）体外生化功能证实,AN7910是新型的非辅因子依赖的脱羧酶家族蛋白,其可专一性地催化diorcinolic acid C2位脱羧生成C10-deoxy gerfelin,其中His68和Arg16是其活性氨基酸位点;（5）体外生化功能证实,AN7911是非金属离子依赖的酰胺水解酶超家族脱羧酶,其可催化C10-deoxy gerfelin C4位脱羧生成diorcinol。综上所述,我们揭示了真菌二苯醚类天然产物新的简短生物合成途径,为后续研究其他真菌二苯醚类天然产物的生物合成途径奠定了基础,也为后续的二苯醚类天然产物的结构改造提供了新的酶催化元件。