背景氧疗是临床常用的一种治疗手段，但持续高浓度氧疗易引起机体氧中毒，在新生儿特别是早产儿易导致慢性肺疾病（CLD）或支气管肺发育不良（BPD）的发生，严重影响患儿健康，目前尚无确切有效的防治方法。肺泡上皮损伤的正常修复主要依赖肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）的增殖与分化，高氧导致AECⅡ氧化应激性损伤，并抑制AECⅡ增殖是BPD发生的主要机制之一。传统抗氧化剂在减轻高氧肺损伤的同时干扰了正常肺发育。氢气（H₂）的选择性抗氧化作用和相对安全性使H₂成为治疗多种疾病的研究热点，但其具体分子机制不清。叉头框蛋白O（FoxO）是一类与氧化应激、凋亡、增殖、发育等密切相关的转录因子，其活性受丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）等多种信号途径调控，而业已证实H₂对MAPKs信号通路中重要的关键酶细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38等的活性和PI3K/Akt信号通路中Akt活性均具有调控作用。我们推测H₂可能通过调控FoxO信号途径对高氧肺损伤发挥保护作用。深入研究H₂在高氧肺损伤中的作用及其FoxO信号机制可能为临床防治BPD带来新突破，为H₂的机制研究带来新进展。目的1.分离培养高纯度、高活力的原代早产大鼠AECⅡ细胞；建立高氧致AECⅡ细胞损伤模型；建立高氧致新生鼠肺损伤动物模型。为后续H₂干预实验及机制研究奠定基础。2.观察H₂对高氧致AECⅡ细胞损伤的作用，探讨其作用是否与FoxO信号途径有关。3.观察H₂对高氧致新生鼠肺损伤的作用，探讨FoxO信号途径在其中的可能机制。方法1. SPF级孕19d Sprague-Dawley（SD）大鼠，水合氯醛麻醉后剖宫产取出胎鼠，分离肺脏，剪碎，胰蛋白酶联合胶原酶消化肺组织细胞，制成细胞悬液，差速离心和反复贴壁纯化AECⅡ，含10%胎牛血清（FCS）的DMEM/F12培养基培养细胞。台盼蓝染色法检测细胞活力，改良巴氏染色法检测细胞纯度，透射电镜鉴定细胞，倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况。2.原代AECⅡ体外培养24h后，随机分为空气组和高氧组，高氧组细胞置于氧体积分数为95%（95%浓度氧）的细胞氧仓中，氧仓与空气组细胞一并放于细胞培养箱中。24h后观察细胞形态，MTT检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞的凋亡及存活情况。3. SD新生大鼠随机分为空气组和高氧组，高氧组大鼠置于氧体积分数为95%的动物氧仓中，与空气组大鼠置于同一室内。3d，7d，14d，21d后取出肺组织行病理学检查，辐射状肺泡计数（RAC），化学比色法测定肺组织羟脯氨酸（HYP）含量。4.原代分离培养的AECⅡ随机分为空气组、高氧组、空气+H₂组、高氧+H₂组。H₂组细胞用富氢培养基干预。24h后观察AECⅡ的形态变化；检测MTT、细胞周期和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达观察细胞增殖情况；检测细胞线粒体膜电位（△Ψ）和凋亡率观察细胞损伤情况；检测细胞内活性氧（ROS）和超氧化物阴离子（O-2）水平，细胞培养上清丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性，观察细胞氧化损伤和抗氧化能力；Western Blot检测细胞总FoxO3a、β-catenin蛋白和p-FoxO3a、p-β-catenin蛋白的表达。5. SD新生大鼠随机分为空气组、空气+富氢生理盐水组、空气+H₂组、高氧组、高氧+富氢生理盐水组和高氧+H₂组。各高氧组大鼠均置于氧体积分数为95%的动物氧仓中。H₂干预：富氢生理盐水组大鼠予腹腔注射富氢生理盐水10mL/kg，每天2次；H₂组大鼠予腹腔注射H₂气体10mL/kg，每天2次。非H₂干预组大鼠则腹腔注射等量生理盐水。14d后，取肺组织做病理学检查；检测大鼠血清MDA水平和SOD活力；测定肺组织HYP含量；免疫组化法测定肺组织α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）表达；Western blot检测肺组织总FoxO3a、β-catenin蛋白和p-FoxO3a、p-β-catenin蛋白的表达。结果1.原代培养的AECⅡ产量较高，每只早产大鼠肺组织可获得（8.5±1.8）×106AECⅡ，细胞活力为（95.0±2.1）％，细胞纯度为（94.3±2.5）％。电镜可见AECⅡ的特征性结构--细胞膜表面的微绒毛和胞浆内的板层小体。AECⅡ体外培养12h左右开始贴壁生长，至18h绝大部分细胞已贴壁伸展，24-48h细胞生长良好，增殖活跃，处于对数生长期，72h后细胞状态逐渐变差，丧失功能。2. AECⅡ予95%浓度氧刺激24h后，细胞出现皱缩变形，细胞间隙增大，增殖较空气组明显受抑，凋亡率明显增加，存活率明显降低。3. SD新生大鼠高氧暴露3d和7d后肺组织出现肺泡上皮细胞肿胀，间质充血水肿，炎性细胞浸润，肺结构紊乱，7d更明显。14d和21d可见纤维增生，肺泡间隔明显增宽，肺组织HYP含量较空气组显著增高，21d更为明显。高氧组RAC值于7d，14d，21d显著低于空气组。4.与空气组比较，空气+H₂组细胞总FoxO3a蛋白表达增加，p-FoxO3a蛋白表达降低，其余各指标均无显著差异。与空气组比较，高氧组细胞OD492值和PCNA蛋白表达明显降低，G1期细胞比例增多而S期细胞比例减少；细胞△Ψ降低，凋亡率增加；细胞内ROS和O-2水平增高；细胞上清MDA含量增高，SOD活性下降；细胞总FoxO3a蛋白表达增加，p-FoxO3a蛋白表达降低；总β-catenin蛋白表达降低，p-β-catenin蛋白表达增高。与高氧组比较，H₂干预可减轻高氧引起的上述改变。5.与空气组比较，空气+富氢生理盐水组和空气+H₂组大鼠肺组织均有FoxO3a与β-catenin的轻微激活，其余各指标均无显著差异；与空气组比较，高氧组肺发育受阻，RAC值降低；肺组织间隔增宽，纤维化明显，肺组织HYP含量增高，α-SMA表达增高；血清MDA水平升高，SOD活力降低；肺组织总FoxO3a蛋白表达增加，且较H₂干预空气组显著，p-FOXO3蛋白表达降低；总β-catenin蛋白表达增加，p-β-catenin蛋白表达亦增高。与高氧组比较，高氧+富氢生理盐水组和高氧+H₂组肺损伤均有所减轻，均一定程度恢复了高氧引起的上述改变。高氧+H₂组血清MDA水平和肺组织HYP含量较高氧+富氢生理盐水组低，差异有统计学意义，其余指标两组间无差异。结论1.采用胰酶联合胶原酶消化、差速离心和反复贴壁的方法获得的原代AECⅡ产量、纯度和活力均较高，可满足细胞学实验研究的需要。AECⅡ体外培养24-48h生长状态最佳，适合做体外研究。2.95%浓度氧可诱导AECⅡ的损伤、凋亡并抑制其增殖，也可导致新生鼠肺损伤和肺发育受阻，成功建立高氧致AECⅡ细胞损伤模型和高氧致新生鼠肺损伤动物模型。3.富氢培养基能一定程度减轻高氧导致的AECⅡ凋亡、氧化损伤，并促进其增殖，而对正常AECⅡ的增殖无明显作用。4.腹腔注射富氢生理盐水和H₂气体均可有效减轻高氧导致的肺损伤，减轻肺纤维化，腹腔注射H₂气体的效果略佳。H₂对正常肺组织无明显作用。5. H₂对高氧导致的细胞和肺损伤的保护作用可能与抑制高氧导致的FoxO3a蛋白过度活化并激活β-catenin蛋白有关。