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产肠毒素大肠杆菌F18(E.coli F18)是引起断奶仔猪腹泻的主要病原菌,是目前规模养猪生产中的重要威胁因素。从长远来看,深入研究断奶仔猪对大肠杆菌抗性的分子机制,进行抗病育种,才是消除该病的治本办法。杀菌通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)属于抗菌类蛋白,在动物机体天然防御中起到了很重要的作用。它不仅可以杀灭革兰氏阴性菌(gram-negative bacterial, GNB),还具有中和内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的活性、调理和促进补体活化和抑制血管生成等一系列生物学功能,而F18大肠杆菌作为革兰氏阴性菌,其细胞壁的主要成分脂多糖LPS(又称为内毒素)也是细菌主要的致病因子。课题组前期研究发现,BPI基因在培育品种苏太猪断奶仔猪肠道中具有明显的组织特异性和发育性表达规律,而且在十二指肠和空肠中的高表达对抗断奶仔猪肠道中E.coli F18的感染可能具有直接作用。1.本研究以中国地方猪品种梅山猪为试验材料,分析BPI基因在梅山断奶仔猪中的组织表达谱,同时分析BPI基因在梅山仔猪从初生到断奶不同发育时期以及E.coli F18抗性型/易感型个体之间的表达差异,进一步分析验证BPI基因的表达规律及其对E.coli F18抗性的作用。Real-time PCR检测梅山猪个体心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴、十二指肠和空肠等11个组织中BPI基因的表达情况。结果表明,BPI基因仅在梅山断奶仔猪肠道组织中高度表达；分析BPI基因在梅山仔猪从初生到断奶5个不同发育时期(7日龄、14日龄、21日龄、28日龄和35日龄)十二指肠及空肠组织中表达水平,结果表明,总体上在十二指肠和空肠中BPI基因表达水平随日龄的增加呈升高趋势。其中,在断奶后的35日龄,BPI基因在十二指肠中的表达水平极显著高于7日龄(P<0.01);28及35日龄BPI在空肠组织中的mRNA表达水平极显著高于7、14和21日龄个体中的表达水平(P<0.01)；进一步比较分析梅山断奶仔猪E coli F18抗性型/易感型个体肠道组织中BPI基因的差异表达,结果表明,BPI基因在抗性型仔猪十二指肠中的表达量极显著高于易感型个体(P<0.01)。本试验结果进一步证实,BPI基因在梅山猪仔猪肠道组织中的表达同样呈现明显的组织特异性和发育性表达规律,而且BPI基因的表达上调也有利于提高梅山猪断奶仔猪对F18大肠杆菌的抗性。2.运用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)测序法检测梅山猪及苏太猪断奶仔猪十二指肠组织中BPI基因启动子区甲基化水平,分析重要甲基化位点对BPI基因mRNA表达水平影响和调控作用。生物信息学分析表明,猪BPI基因外显子1及上游5000bp区域存在一个CpG岛,共包含10个CpG位点。BSP测序结果表明,苏太猪BPI基因启动子区10个CpG位点甲基化程度普遍高于梅山猪个体,甲基化水平与表达量相关性分析表明,BPI基因CpG岛整体的甲基化程度与mRNA表达之间呈一定负相关性(r=-0.686r0.05=0.811),其中CpG-3、CpG-7、CpG-9位点呈显著负相关(P<0.05),CpG-2呈极显著负相关(P<0.01)。说明该区域CpG-2、CpG-3、CpG-7、CpG-9等重要的甲基化位点可能抑制了基因的表达,今后有望通过对这些位点的去甲基化提高BPI的表达水平,从而提高肠道组织对于革兰氏阴性菌的抵抗能力。3.采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)+Miseq测序的方法,以课题组前期建立的苏太断奶仔猪E coli F18抗性型/易感型个体的肠道组织为检测对象,分析重要甲基化位点对BPI基因mRNA表达水平的影响和调控作用,探讨BPI基因启动子区甲基化水平在仔猪抵抗E coil F18感染过程中的调控机制,BSP+Miseq检测结果表明,mC-3、mC-14和mC-15等位点的甲基化水平在抗性型/易感型个体的肠道组织中存在很大的差异；E. coliF18抗性型/易感型个体在肠道组织中BPI基因整体甲基化水平与表达量呈现显著负相关(r=-0.611,r005=0.497),mC-7位点呈极显著负相关(r=-0.64l,r0.01=0.623),mC-15位点存在显著负相关(r=-0.564)。在一定程度上说明,E. coli F18抗性型/易感型个体的表达差异与BPI基因部分位点的甲基化有关,mC-15位点的甲基化可能在E coli F18抗性的过程中发挥了重要的调控作用。4.采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)+Miseq测序的方法,检测苏太断奶仔猪11个不同组织BPI基因启动子区甲基化水平,探讨BPI基因的组织特异性表达是否与甲基化修饰有关。对甲基化扩增片段分析发现,该片段共包含了15个CG位点,且都发生了不同程度的甲基化,除此之外,mC-8和mC-10的CAC位点,15号的CAA位点也发生了甲基化；苏太断奶仔猪11个不同组织中BPI基因启动子区甲基化水平不同,结合mRNA表达水平分析发现,不同组织BPI基因整体的甲基化与表达水平呈显著负相关(r=-0.41,r0os=0.34)。其中mC-15位点与基因表达存在显著负相关(r=-0.42,r0.05=0.34),对扩增片段进行生物信息学分析,有12个潜在的转录因子结合位点分布在扩增片段上,其中第3、4、5、15甲基化位点位于Sp1和C/EBPp转录因子结合位点上。结合EMSA试验验证,发现mC-15位点甲基化位点在一定程度上抑制了Sp1和C/EBPP转录因子与BPI基因启动子区的结合,进而影响基因在不同组织中的表达水平。